Bu yazımızda DNA dizileme yöntemlerine ilişkin bir takım bilgiler paylaşmayı hedefliyoruz. DNA dizileme neden yapılır, hangi teknikler kullanılır, bizlere nasıl bir fayda sağlar gibi farklı alt başlıklarda kısaca konuyu toparlayacağız.

DNA dizilemeyi basitçe şu şekilde tanımlayabiliriz; bir DNA ipliğinde bulunan 4 farklı bazın (A,G,C,T), kesin ve doğru bir sırada dizilenmesine DNA dizilimi (DNA sequencing) denir.

Öncelikle insanlarda genetik yapıya  geri dönüş yapalım ve bazı sayısal bilgilerden söz edelim. Bildiğiniz gibi insanlar 23 çift kromozoma yani toplamda 46 kromozoma sahiptirler ve bu kromozomlar 50,000,000 dan 300,000,000 a kadar değişen baz çifti (A-T, G-C bazlarının karşılıklı ipliklerde kimyasal bağlarla -hidrojen bağı-  birleşerek oluşturdukları çift yapı) içerirler. Bu da yaklaşık olarak 3,2 milyar DNA bazına tekabül eder.  Sayıyı düşündüğümüz zaman oldukça uzun bir DNA zincirine sahip olduğumuz hakkında doğrudan çıkarım yapabiliriz. Peki bu uzunlukta bir DNA ipliğini baştan sona sürekliliğini bozmadan dizilemek mümkün müdür? Günümüzde geliştirilmiş olan tekniklere bakacak olursak, cevabımız hayır. DNA dizilimi yapılabilmesi için öncelikle bu uzun iplikli molekülü küçük parçalara bölmemiz gerekir. Daha sonra tüm kısa DNA parçalarının dizilemesi yapılır ve bilim insanları elde edilen verileri birleştirerek genetik bir harita oluşturur. Günümüzde bir insanın genomu -3,2 milyar baz- saatler içerisinde dizilenebilir.

SANGER Dizileme

Genom dizileme, mutasyonları direk olarak saptama adına önemli bir tekniktir. Tarihte geliştirilen ilk en doğru DNA dizileme tekniği Sanger dizilemedir. 1977 yılında Frederick Sanger tarafından geliştirilen bu metodun prensibi dideoksi nükleotitler ile zincir sonlandırmadır.

Dideoksi nükleotit, DNA zincirindeki şeker molekülünün 2’ ve 3’ karbon uçlarında hidroksil grubunu bulundurmayan nükleotitlerdir. Bu yapı taşları DNA zincirine eklendiği anda hidroksil grubu eksikliği nedeni ile DNA ipliğine başka bir nükleotit eklenemez ve zincir sonlanmış olur. Bu metodu uygulamak için dört farklı tüpe dizilemek istenilen alanı içeren DNA parçaları (PCR malzemeleri kullanılarak aynı sekans çoğaltılır ve birden fazla DNA parçası elde edilir), primer, nükleotitler, DNA polimeraz enzimi(yeni ipliği sentezlemek için) ve dideoksi nükleotitler eklenir. Her tüpe bir tür dideoksi nükleotit eklenir. Dizi okumasını sağlamak amacıyla dideoksi nükleotitlere işaretleme yapılır. Gelişen yöntemler ile floresan boyalı işaretlemeler yapılmaktadır. Elimizdeki tüm malzemeler dört farklı tüpte birleştirilir. Sonuç olarak farklı uzunluklarda parçalar elde edilir. Burada önemli olan nokta her tüpe yalnızca bir tür dideoksi nükleotit eklenmiş olmasıdır. Örneğin 1. tüpe ddATP, 2. tüpe ddGTP 3.tüpe ddCTP, 4.tüpe ddTTP eklenir. 

Bu dideoksi nükleotitler çoğaltılmış olan DNA molekülünü farklı uzunluklarda sonlandırır. Daha sonra dizilemeyi yapmak amacıyla kapiler jel elektroforezinde DNA parçaları yürütülür. Kısa parçalar uzun parçalara göre hızlı bir şekilde hareket ederler. Lazer ışınları ile gerçekleştirilen yansıma kromatogram ile DNA dizisinin okunmasında görev alır.  Jel sonuçlarına göre aşağıdan başlayarak yukarı doğru lazer ile işaretlenmiş parçalar saptanır ve elde edilen veriler ile istediğimiz DNA sekansını dizilemeyi başarıyla tamamlamış oluruz.

Sanger dizileme yönteminin birçok avantajı ve dezavantajı bulunmaktadır. Avantajlarından bahsedecek olursak; Eğer yalnızca belli spesifik bir gen dizilemesine bakılmak isteniyorsa, gen dizisindeki kısa bir bölgeye bakılmak isteniyorsa, bilinen bir mutasyon için dizileme isteniyorsa, tüm genomu dizilemek yerine Sanger metodunu kullanmak daha hızlı ve ucuz bir yöntem olabilir. Hata oranı en düşük olan dizileme yöntemidir. Ancak dezavantajlarına değinmek gerekirse; tüm bir genom dizilenmek istendiğinde oldukça pahalı bir yöntemdir. Her bir reaksiyonda 250-500 baz çifti dizilemesi yapılabilir. Dizilerin kısa olması sebebiyle çok sayıda DNA parçası çoğaltımı gerektirir bu da maliyeti yükseltir. Geliştirilmiş olan diğer yöntemlere göre daha yavaştır. İnsan genom projesinde de genom dizilimi Sanger metodu ile yapılmıştır ve 13 yıl sürmüştür.

DNA Dizileme Yöntemleri (biyoinformatikdunyasi.blogspot.com): DNA Dizileme Yöntemleri