_{Mandy Alhajj ; Muhammed Zübeyr ; Aisha Farhana}

Enzim immünolojik analizleri (EIA’lar), immünolojik reaksiyonları tespit etmek ve ölçmek için enzimlerin katalitik özelliklerini kullanır. Enzim bağlantılı immünosorbent analizi (ELISA), klinik analizlerde kullanılan heterojen bir EIA tekniğidir. Bu tür analizde, reaksiyon bileşenlerinden biri, bir mikrotitre kuyusu, manyetik bir parçacık veya plastik bir boncuk gibi katı bir fazın yüzeyine spesifik olmayan bir şekilde adsorbe edilir veya kovalent olarak bağlanır. Bu bağlantı, bağlı ve serbest etiketli reaktanların ayrılmasını kolaylaştırır. ELISA tekniğini kullanmanın en yaygın yaklaşımında, kantifize edilecek antijeni (Ag) içeren bir numune veya kalibratör alikotu, katı fazlı bir antikora (Ab) eklenir ve bağlanmasına izin verilir. Yıkamadan sonra, enzimle etiketlenmiş bir antikor eklenir ve katı fazlı Ab-Ag-Ab enziminin bir “sandviç kompleksi” oluşturur. Daha sonra bağlanmamış antikor yıkanır ve enzim substratı eklenir. Üretilen ürün miktarı, numunedeki antijen miktarıyla orantılıdır. Bir numunedeki spesifik antikorlar, antikor yerine antijenin katı bir faza bağlandığı bir ELISA prosedürü kullanılarak da ölçülebilir. İkinci reaktif, analit antikoruna özgü enzim etiketli bir antikor.

Ek olarak, ELISA analizleri serum veya tam kanda virüslere ve otoantijenlere karşı antikorları tespit etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Ek olarak, görünür ürünler üreten substratlarla birleştirilmiş enzim konjugatları, görsel olarak yorumlanabilen sonuçlarla ELISA tipi analizler geliştirmek için kullanılmıştır. Bu tür analizler tarama, bakım noktası ve evde test uygulamalarında çok faydalıdır.

Etiyoloji ve Epidemiyoloji

İki farklı araştırma ekibi aynı anda doğrudan ELISA’yı icat etti: bilim insanları Engvall ve Perlman ile bilim insanları Van Weemen ve Schuurs. ELISA, radyoimmunoassay’in (RIA) modifikasyonuyla geliştirildi. Bu, etiketli antijenlerin ve antikorların radyoaktif iyot 125 yerine enzimlerle konjuge edilmesiyle yapıldı. Yeni yöntem ilk olarak tavşan serumundaki IgG seviyelerinin belirlenmesinde kullanıldı. Aynı yıl içinde bilim insanları, yaban turpu peroksidazı kullanarak idrarda insan koryonik gonadotropinini ölçtüler. O zamandan beri, ELISA yöntemi birçok farklı uygulamada kullanıldı ve dünya çapında rutin bir laboratuvar araştırması ve teşhis yöntemi haline geldi.

İlk ELISA metodolojisi, antijenin varlığını izleyen gözlemlenebilir renk değişimini oluşturmak için kromojenik haberci molekülleri ve substratları içeriyordu. ELISA tekniğindeki daha fazla ilerleme, sinyaller oluşturmak için florojenik, kantitatif PCR ve elektrokemilüminesan habercilerin geliştirilmesine yol açtı. Ancak, bu tekniklerin bazıları enzime bağlı substratları kullanmaya değil, ELISA ilkesini kullanan enzimatik olmayan habercilere dayanmaktadır. 2012’deki son gelişme, nanopartikülleri kromojenik haberciler olarak işleyen ultra hassas enzim tabanlı bir ELISA’ydı. Bu teknik, çıplak gözle görülebilen bir renk sinyali üretebilir; mavi renk pozitif sonuçları, kırmızı renk ise negatif sonuçları gösterir. Ancak bu yöntem niteldir ve yalnızca bir analitin varlığını veya yokluğunu belirleyebilir, konsantrasyonunu değil.

Numune Gereksinimleri ve Prosedürü

ELISA’lar, genellikle proteine güçlü bir şekilde bağlanmak üzere kaplanmış 96-kuyulu plakalar olan polistiren plakalarda gerçekleştirilir. ELISA türüne bağlı olarak, test birincil ve/veya ikincil tespit antikoru, analit/antijen, kaplama antikoru/antijeni, tampon, yıkama ve substrat/kromojen gerektirir. Birincil tespit antikoru, yalnızca ilgi duyulan proteine bağlanan spesifik bir antikor. Bunun aksine, ikincil tespit antikoru, enzimle konjuge olmayan birincil bir antikorla bağlanan ikinci bir enzimle konjuge antikor.

Bir ELISA immunoassay’i tamamlamak için dört ana genel adım vardır. Bu adımlar şunlardır: Kaplama (antijen veya antikor ile)

Blokaj (tipik olarak sığır serum albümini [BSA] ilavesiyle)

TespitSon okuma Tespit, bir renk üretebilen bir substrat eklenerek gerçekleştirilir. ELISA tespitinde kullanılmak üzere birçok substrat mevcuttur. Ancak, en yaygın kullanılan substratlar yaban turpu peroksidaz (HRP) ve alkalin fosfatazdır (AP). HRP için substrat hidrojen peroksittir ve mavi renk değişimine neden olur. AP, 15 ila 30 dakikalık oda sıcaklığında inkübasyon sürelerinden sonra nitrofenolün sarı rengini ölçer ve genellikle substratı olarak p-nitrofenil-fosfat (pNPP) kullanır.

Yukarıdaki dört adımın her biri arasında, bağlanmamış materyali çıkarmak için fosfat tamponlu salin (PBS) ve iyonik olmayan bir deterjan gibi bir tampon kullanılarak plakanın “yıkanması” vardır. Kuyular, belirli protokole bağlı olarak her yıkama adımında iki veya daha fazla kez yıkanır. Alışılmış bir ELISA protokolünde, konsantrasyonların seri seyreltmesi plakanın kuyularına yerleştirilir. Sonuçlar ölçüldükten sonra, seri seyreltme verilerinden bir standart eğri, x ekseninde bir logaritmik ölçek kullanılarak bir konsantrasyon ve y ekseninde doğrusal bir ölçek kullanılarak bir absorbans ile çizilir. [8]ELISA’nın dört ana türü vardır:

Direkt ELISA (antijen kaplı plaka; tarama antikoru)

Dolaylı ELISA (antijen kaplı plaka; antijen/antikor taraması)

Sandviç ELISA (antikor kaplı plaka; antijen taraması)

Rekabetçi ELISA (tarama antikoru)

Doğrudan ELISA

Hem doğrudan hem de dolaylı ELISA’lar antijenlerin ELISA plakalarına kaplanmasıyla başlar. İlk bağlanma adımı, 37 °C’de bir saat inkübe edilen veya bir gece boyunca 4 °C’de inkübe edilebilen plakalara antijen eklemeyi içerir. İnkübasyon adımı tamamlandıktan sonraki adım, plakaları olası bağlanmamış antijenlerden yıkamak ve BSA, ovalbümin, aprotinin veya diğer hayvansal proteinler gibi ajanlar kullanarak ELISA plakasındaki bağlanmamış bölgeleri bloke etmektir. Bu ikinci adım, plakaya herhangi bir spesifik olmayan antikorun bağlanmasını önlediği ve yanlış pozitif sonuçları en aza indirdiği için önemlidir. Tampon eklendikten sonra, plaka tekrar yıkanır ve seçilen enzimle konjuge edilmiş birincil tespit antikoru eklenir. Plaka bir saat daha inkübe edilir. Doğrudan ELISA’da, birincil tespit antikoru doğrudan ilgili proteine bağlanır. Daha sonra, bağlanmamış antikorları çıkarmak için plaka yeniden yıkanır. Plakaya alkalin fosfataz (AP) veya yaban turpu peroksidazı (HRP) gibi bir enzim eklenir ve bu da bir renk değişimine neden olur. Örneğin renk değişimi, AP tarafından substrattan fosfat gruplarının hidrolizi veya HRP tarafından substratların oksidasyonu ile gerçekleşir. Doğrudan ELISA kullanmanın avantajları arasında ikincil antikor çapraz reaktivitesini ortadan kaldırması ve daha az adım olması nedeniyle dolaylı ELISA’ya kıyasla hızlı olması yer alır. Dezavantajları arasında diğer ELISA türlerine kıyasla düşük hassasiyeti ve yüksek reaksiyon maliyeti yer alır.

Dolaylı ELISA

Dolaylı ELISA’nın adımları, ek bir yıkama adımı ve tampon çıkarıldıktan sonra eklenen antikor tipleri dışında, doğrudan ELISA ile aynıdır.

Dolaylı ELISA, iki antikor gerektirir: ilgi duyulan proteine yapışan birincil tespit antikoru ve birincil antikoru tamamlayan ikincil enzim bağlantılı antikor. Önce birincil antikor eklenir, ardından bir yıkama adımı gelir ve ardından enzimle konjuge ikincil antikor eklenir ve inkübe edilir. Bundan sonra adımlar, bir yıkama adımı, substrat eklenmesi ve bir renk değişiminin tespitini içeren doğrudan ELISA ile aynıdır.

Dolaylı ELISA, doğrudan ELISA ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir duyarlılığa sahiptir. Ayrıca, kullanılabilen birçok olası birincil antikor nedeniyle daha az maliyetli ve daha esnektir. Bu ELISA türünün tek büyük dezavantajı, ikincil tespit antikorları arasında çapraz reaksiyon riski olmasıdır.

Sandviç ELISA

Doğrudan ve dolaylı ELISA’nın aksine, sandviç ELISA, plakanın kuyularına kaplanmış bir yakalama antikoruyla başlar. Antijenler iki antikor tabakası (yakalama ve tespit antikorları) arasına yerleştirildiği için buna “sandviç” adı verilir. Yakalama antikoru plakalara eklendikten sonra, plakalar kapatılır ve 4 °C’de bir gece inkübe edilir. Kaplama adımı tamamlandıktan sonra, plakalar PBS ile yıkanır ve ardından BSA ile tamponlanır/bloke edilir. Tampon yıkamaları oda sıcaklığında en az 1 ila 2 saat gerçekleştirilir. Son olarak, antijen eklenmeden önce plaka bir kez daha PBS ile yıkanır. İlgi duyulan antijen, yakalama antikoruna bağlanmak üzere plakalara eklenir ve 37 °C’de 90 dakika inkübe edilir. Plaka tekrar yıkanır ve birincil tespit antikoru plakaya eklenir ve oda sıcaklığında 1 ila 2 saat daha inkübe edilir, ardından bir tampon yıkama yapılır. Daha sonra ikincil enzimle konjuge antikor eklenir ve 1 ila 2 saat daha inkübe edilir. Plaka tekrar yıkanır ve bir renk değişimi oluşturmak için substrat eklenir.

Sandviç ELISA, tüm ELISA tipleri arasında en yüksek duyarlılığa sahiptir. Bu ELISA tipinin en büyük dezavantajları zaman ve masraf ile “eşleşmiş çift” (divalent/multivalent antijen) ve ikincil antikorların gerekli kullanımıdır.

Rekabetçi ELISA

Rekabetçi ELISA, test serumunda antijenlere özgü bir antikorun varlığını test eder. Bu ELISA türü iki özgül antikor kullanır: enzimle konjuge edilmiş bir antikor ve test serumunda bulunan başka bir antikor (serum pozitifse). İki antikorun kuyulara birleştirilmesi antijenlere bağlanmak için rekabete izin verecektir. Bir renk değişiminin varlığı, enzimle konjuge edilmiş antikorun antijenlere (test serumunun antikorlarına değil) bağlanması nedeniyle testin negatif olduğu anlamına gelir. Rengin olmaması, pozitif bir test ve test serumunda antikorların varlığını gösterir.

Rekabetçi ELISA düşük bir özgüllüğe sahiptir ve seyreltilmiş numunelerde kullanılamaz. Bununla birlikte, daha az numune saflaştırmaya ihtiyaç duyulması, belirli bir numunede geniş bir antijen aralığını ölçebilmesi, küçük antijenler için kullanılabilmesi ve düşük değişkenliğe sahip olması avantajlarıdır.

Tanı Testleri

Enzim bağlantılı immünosorbent analizleri birçok tanı testinde uygulanır. ELISA’nın bazı kullanımları şunları içerebilir:

Kanda Antikorların Varlığını Tespit Etme ve Ölçme

Otoantikorlar (anti-dsDNA, anti-dsg1, ANA, vb.)

Bulaşıcı hastalıklara karşı antikorlar (antibakteriyel, antiviral, antifungal)Hepatit A, B, C, HIV vb.Tümör Belirteçlerinin Düzeylerini Tespit Etmek ve Tahmin Etmek

Prostat spesifik antijen (PSA)Karsinoembriyonik Antijen (CEA)Hormon Seviyelerini Tespit Etme ve Tahmin Etme

Luteinize edici hormonFoliküler uyarıcı hormon

ProlaktinTestosteronİnsan koryonik gonadotropin (hCG)Hastalık Salgınlarının Takibi

Kolera

HIV

Grip

Geçmiş Maruziyetlerin Tespiti

HIV

Lyme hastalığı

Hepatit

Bağışlanan Kanda Olası Viral Kirleticilerin Taranması

HIV-1/2’ye Karşı

HCV’ye karşı

HBsAg Uyuşturucu Madde İstismarını Tespit Etmek

Amfetamin

Metamfetamin3,4-metilendioksimetamfetamin

Kokain

Benzoilekgonin

Karışan Faktörler

Uygun ELISA testine müdahale edebilecek faktörler, numune toplama ile başlayarak test sürecinin herhangi bir aşamasında ortaya çıkabilir. Analiz plakasının, kaplama tamponunun, yakalama antikorunun, blokaj tamponunun, hedef antijenin, tespit antikorunun, enzim konjugatının, yıkamaların, substratın ve sinyal tespitinin kalitesi ve bütünlüğü, uygun ELISA testine müdahale edebilir. Teste müdahale edebilecek faktörlerden bazıları şunlardır:

Plaka Testi: kuyuların şekli ve kalitesi, plakanın malzemesi, potansiyel ön aktivasyon ve eşit veya eşit olmayan kaplama. Tampon: pH, kontaminasyon. Antikor yakalama ve tespiti: inkübasyon süresi, sıcaklık, özgüllük, titre, afinite. Blokaj tamponu: çapraz reaksiyon, konsantrasyon, kontaminasyon. Hedef antijen: konformasyon, stabilite, epitoplar. Enzim konjugatı: tip, konsantrasyon, fonksiyon, çapraz reaktivite. Yıkamalar: kontaminasyon, sıklık, hacim, süre, bileşim.

Alt tabaka: kalite/üretici.

Tespit: cihaza bağlı faktörler. [16]Okuyucu/insan hatası.

Sonuçlar,

Raporlama ve Kritik Bulgular

ELISA testlerinden toplanan veriler nicel, nitel veya yarı nicel olabilir. Nicel konsantrasyon sonuçları çizilir ve standart bir eğri ile karşılaştırılır. Nitel sonuçlar, bir numunedeki belirli bir antijen/antikorun varlığını doğrular veya reddeder. Yarı nicel sonuçlar, bir numunedeki bağıl antijen seviyelerine ulaşabilen sinyallerin yoğunluğunu karşılaştırır. Renk değişimleri deneyden ölçüldüğünde, sonuçlar ya kağıt üzerinde ya da yazılımda grafiklendirilir.

Tipik olarak, grafik optik yoğunluğu logaritmik konsantrasyonla karşılaştırır ve bu da sigmoidal bir eğri verir. Bilinen konsantrasyonlar grafiğin standart eğrisini verir ve daha sonra bilinmeyenlerin ölçümü, örnek değerleri grafiklenen standart eğrinin doğrusal kısmıyla karşılaştırıldığında gerçekleşebilir.

Klinik Önemi

ELISA’lar, İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü (HIV) için hızlı antikor tarama testleri, diğer virüslerin, bakterilerin, mantarların, otoimmün hastalıkların, gıda alerjenlerinin tespiti, kan grubunun belirlenmesi, gebelik hormonu hCG’nin varlığı, laboratuvar ve klinik araştırmalar, adli toksikoloji ve diğer birçok tanı ortamı dahil olmak üzere birçok ortamda kullanılabilir. HIV testinde, genellikle dolaylı ELISA tabanlı testler kullanılarak test için kan veya tükürük örneği toplanır.

ELISA, HIV tespiti için bir tarama aracıdır, ancak tanı amaçlı değildir. Teşhis, olası yanlış pozitifler nedeniyle Western blot ile daha fazla test gerektirir. Çocukların ve genç yetişkinlerin cildini sıklıkla enfekte eden başka bir virüs olan Molluscum contagiosum virüsü (MCV), ELISA testi ile tespit edilebilir. Bu ortamda ELISA testi şu anda küresel MCV seroprevalansını değerlendirmek için değerlendirilmektedir. ELISA ayrıca pemfigus ve büllöz pemfigoid otoimmün büllöz hastalıklarda yer alan desmoglein 1 ve 3 ve büllöz pemfigoid antijen 180 otoantikorlarını tespit etmek için de kullanılmıştır. Gıda alerjisinde ELISA’nın evrimi alerji araştırmalarında ve tanısında önemli bir rol oynamıştır. Pikogram ölçeğinde alerjen miktarlarını tespit etmek için ultra hassas ELISA varyasyonları geliştirilmiştir. Bu, gıda alerjilerinin halk sağlığı ölçeğinde sahip olabileceği yaşamı tehdit edici rol nedeniyle önemlidir.

Kalite Kontrol ve Laboratuvar Güvenliği

Nicel prosedürlerde olduğu gibi, nitel ve yarı nicel incelemelerin sonuçlarının, talep eden sağlık hizmeti sağlayıcısına bildirilmeden önce doğru olduğunu doğrulamak önemlidir. Laboratuvar, tüm nitel ve yarı nicel testleri için bir kalite kontrol programı oluşturmalıdır. Bu programı oluştururken politikalar belirleyin, personeli eğitin, sorumlulukları atayın ve gerekli tüm kaynakların mevcut olduğundan emin olun. Tüm kalite kontrol verilerinin kaydının tamamlandığından ve kalite yöneticisinin ve laboratuvar müdürünün bilgilerin uygun bir incelemesini yaptığından emin olun. Bazı özel boyalar veya reaktifler kullanan prosedürler ve aglütinasyon veya renk değişimi gibi uç noktalara sahip testler dahil olmak üzere birçok nitel ve yarı nicel test için pozitif ve negatif kontroller önerilir. Bu kontroller genellikle her test çalışmasında kullanılmalıdır. Kontrollerin kullanımı ayrıca yeni bir test kiti veya reaktif parti numarasını doğrulamaya, depolama ve test alanlarının sıcaklıklarını kontrol etmeye ve yeni test personeli testi gerçekleştirirken süreci değerlendirmeye yardımcı olacaktır. Geleneksel kontrolleri nitel veya yarı nicel testler için kullanırken şunları aklınızda bulundurun: kontrol materyallerini hasta örneklerini test ettiğiniz şekilde test edin; pozitif ve negatif bir kontrol kullanın, tercihen testin her gününde bir kez veya en azından üretici tarafından önerildiği kadar sık kullanın; testin zayıf pozitif reaksiyonları tespit edebildiğinden emin olmak için testin kesme değerine yakın pozitif kontroller seçin; aglütinasyon prosedürleri için zayıf pozitif kontrolün yanı sıra negatif kontrol ve daha güçlü pozitif kontrol ekleyin. Laboratuvarda çalışırken laboratuvar davranışı için temel güvenlik kurallarına uyulmalıdır. Tüm numuneleri, kontrol materyallerini ve kalibratör materyallerini potansiyel olarak bulaşıcı olarak değerlendirin. Tüm laboratuvar reaktiflerini işlemek için gereken olağan önlemleri alın. Tüm atık materyallerin bertarafı yerel yönergelere uygun olmalıdır. İnsan kanı örneklerini işlerken eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü takın. Kanla temas eden tüm plastik uçları, örnek kaplarını ve eldivenleri biyolojik tehlike atık konteynerine koyun. Tüm tek kullanımlık cam eşyaları keskin atık konteynerlerine atın. Tüm çalışma yüzeylerini tek kullanımlık emici tezgah üstü kağıtla koruyun, haftalık olarak veya kan kontaminasyonu meydana geldiğinde biyolojik tehlike atık konteynerlerine atın. Tüm çalışma yüzeylerini haftalık olarak silin. Tüm ekipmanlar aşınma veya bozulma açısından düzenli olarak incelenmelidir. Ekipman, üreticinin gereksinimlerine göre bakımlı olmalı ve sertifika, bakım veya onarım kayıtları ekipmanın ömrü boyunca saklanmalıdır. Bilgisayarlar ve aletler, eldiven giyilip giyilmemesi gerektiğini belirtmek için etiketlenmelidir. Klavyelerin/tuş takımlarının etrafında tutarsız eldiven kullanımı olası bir kontaminasyon kaynağıdır. Laboratuvarda takı takmaktan kaçının, çünkü bu birden fazla güvenlik tehlikesi oluşturabilir. Laboratuvara özgü işlemler için güvenlik kuralları uygun laboratuvar SOP’larında sağlanacaktır.

Sağlık Ekibi Sonuçlarını Geliştirmek

ELISA testi tıbbi bakım ve bilimsel araştırmanın önemli bir parçasıdır. Bilim insanları, laboratuvar teknisyenleri, flebotomistler, klinisyenler, hemşireler ve diğer tıp uzmanları arasındaki iş birliği, uygun örnek toplama, test etme, yorumlama, tanı ve etkili hasta eğitimi ve tedavi planlaması için gereklidir. ELISA teknolojileri büyümeye devam ediyor ve klinik araştırmalarda önemli bir rol oynuyor, daha fazla tanı ve tarama testinin geliştirilmesine olanak sağlıyor. ELISA testinin sürekli evrimi tıbbın geleceği için umut vericidir ve HIV’in erken teşhisini ve gebelik tespitini iyileştirmiştir.

Kaynak: Yazının Ana kaynağı