Hiperglisemi gibi olumsuz intrauterin ortamlar, eşeyli üremeyi ve tür devamlılığını bozar, ancak altta yatan mekanizmalar hala yeterince anlaşılmamıştır. Bu çalışmada, intrauterin hipergliseminin, özellikle dişi yavrularda, primordial germ hücresi (PGC) gelişimini önemli ölçüde bozduğunu ve böylece doğurganlığı azalttığını gösterdik. Rahim içi hiperglisemiye maruz bırakılan 
Oct4-EGFP transgenik fareleri kullanarak, hipergliseminin PGC gelişimi sırasında cinsel olarak spesifik kromatin erişilebilirliğini ve DNA metilasyon yeniden programlamasını tehlikeye attığını ortaya koyduk

Özellikle dişi PGC’lerde hiperglisemi, Nanog ve Tfap2c gibi pluripotens gen promotörlerinde kromatin erişilebilirliğinin anormal bir şekilde tutulmasına yol açarak , uygun gen susturulmasını inhibe eder ve mayozun başlamasını bloke eder, bu da sonuçta oosit olgunlaşmasını engeller. Tersine, erkek PGC’ler kromatin erişilebilirliğinde ve gen transkripsiyonunda daha az şiddetli değişiklikler gösterir. İlginç bir şekilde, erkek PGC’lerde, özellikle de önemli baskılanmış gen bölgelerinde, küresel DNA metilasyon rekonstrüksiyonu bozulmuştur ve bu durum, sonraki aşamalar ve hatta sonraki nesiller için potansiyel gelişimsel sonuçlar doğurabilir. Bulgularımız, özellikle intrauterin hipergliseminin, kritik cinsiyet belirleyici transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu bozarak PGC’lerde cinsiyet farklılaşmasını olumsuz etkilediğini göstermektedir. Bu bulgular topluca, intrauterin hipergliseminin PGC gelişimi sırasında cinsiyete özgü epigenetik yeniden programlamayı nasıl etkilediğini ve anormal germ hücresi gelişimine, doğurganlığın azalmasına ve nesiller arası olumsuz etkilere nasıl yol açtığını vurgulamaktadır.

giriiş

Olumsuz bir intrauterin ortama maruz kalmak, epigenetik yeniden programlamayı tetikleyebilir ve kritik gelişim aşamalarında gen ifadesini değiştirerek yaşamın ilerleyen dönemlerinde kronik hastalık riskini artırabilir ^{1 , 2 , 3} . Gebelik sırasında en sık görülen komplikasyon olan gestasyonel diabetes mellitus (GDM) gibi intrauterin hiperglisemi (IUHG), ^4 , 5 , yavruların sağlığı üzerinde derin ve kalıcı etkilere neden olur ^6 , 7 . Bununla birlikte, IUHG’nin yavruların üreme sistemi üzerindeki olumsuz etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde keşfedilmemiş durumdadır.

PGC’lerin gelişimi ve gametlere farklılaşması memeli üremesi için kritik öneme sahiptir. Farelerde, PGC gelişimi belirgin cinsiyete özgü farklılıklar gösterir. Örneğin, dişi PGC’ler kademeli olarak pluripotensi aşamasından çıkar ve embriyonik gün 13.5 (E13.5) civarında mayoz bölünmeye başlarken, erkek PGC’ler doğuma kadar mitotik aşamada hareketsiz kalır ^8 , 9 . Sox2 ve Nanog gibi pluripotensi genleri , PGC’lerin göçü ve çoğalması için gereklidir ^10 , 11 . Stra8 , mayoz bölünmeyle ilişkili önemli bir gendir ve mayoz bölünmeye özgü genlerin ifadesini teşvik etmekten ve PGC’lerde somatik programın kurulmasını baskılamaktan sorumludur ^{12 , 13 , 14} . Pluripotensi programından normal çıkış ve mayoz bölünmeye giriş, gamet üretimi için vazgeçilmezdir.

Epigenetik yeniden programlama, germ hücresi gelişimi sırasında gen ekspresyonu, mayoz, genom bütünlüğü ve genomik baskılamada önemli roller oynar ¹⁵ . PGC gelişimi sırasında, genom çapında epigenetik yeniden programlama pluripotensin korunmasıyla eş zamanlı olarak meydana gelir ¹⁶ ve bu da cinsiyete özgüllük gösterir. Örneğin, kromatin manzarası mayoz sırasında sinaptonemal kompleks oluşumu ve homolog rekombinasyon gibi önemli süreçler tarafından yönlendirilen derin bir yeniden organizasyona uğrar ¹⁷ . Erkek ve dişi germ hücreleri arasındaki mayoz girişinin farklı zamanlaması, cinsiyete özgü kromatin açıklık dinamiklerine katkıda bulunabilir. PGC’ler ayrıca her iki cinsiyette de E8.5’ten E13.5’e kadar kapsamlı bir global demetilasyona uğrar ve düzenleyici bölgeleri etkiler ¹⁸ . E13.5’ten sonra, erkek PGC’ler özellikle spermatogenezle ilgili genler ve bölgeler üzerinde DNA metilasyonunu yeniden oluşturmaya başlar ¹⁹ . Buna karşılık, dişi PGC’ler oosit gelişiminin sonraki aşamalarına kadar düşük DNA metilasyon seviyelerini korurlar ^18 , 20 . PGC gelişimi sırasında epigenetik yapıların doğru bir şekilde yeniden oluşturulması, uygun gen ifadesinin ayarlanması için çok önemlidir. Rahim içi ortamda PGC gelişiminin temel süreçleri göz önüne alındığında, hiperglisemi gibi maternal metabolik bozukluklar, yavruda anormal epigenetik yeniden programlamaya ve gen ifadesine yol açabilir ve bu durum daha fazla araştırma gerektirmektedir.

Streptozotosin (STZ), kısa yarı ömrü nedeniyle hızlı ancak geçici in vivo aktivitesiyle hiperglisemiyi indüklemek için kullanılır ve hiperglisemi kaynaklı etkilerin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir model görevi görür ^21 , 22 . Bu modelle, maternal hipergliseminin oositlerde TET3’ü azalttığını, paternal genom demetilasyonunu bozduğunu ve yavru metabolizmasını etkilediğini kanıtladık ²² . Ayrıca GDM’nin erkek testis gelişimini bozabileceğini ve PGC’lerde DNA metilasyon anomalilerini indükleyebileceğini ve böylece kuşaklar arası metabolik sonuçları etkileyebileceğini gösterdik ^23 , 24 . Diğer araştırmalar hipergliseminin farelerde oosit mayozunu ve gelişimini bozduğunu göstermiştir ²⁵ . Bu bulgulara rağmen, yavru PGC’leri ve gonadları doğrudan yüksek glikozlu bir ortama maruz kaldığında hipergliseminin PGC gelişimini nasıl etkilediğinin mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır. Dahası, GDM yavrularında cinsiyet farklılıklarının nasıl elde edildiği daha fazla araştırılmayı beklemektedir. Bu çalışmada, IUHG’nin pluripotent transkripsiyon faktörlerinde transkripsiyonel değişiklikler olmaksızın E12.5 PGC’lerinde kromatin yapısını değiştirdiğini bulduk. Bu bozulma, E13.5 dişi PGC’lerinde pluripotent gen düzenleyici ağının kapatılamamasına, mayoz bölünmeye uygun girişin bozulmasına, fetal oosit sayısının azalmasına ve doğurganlığın azalmasına yol açar. Buna karşılık, erkek PGC’lerinde IUHG, DNA metilasyonunun yeniden programlanmasını bozarak sperm konsantrasyonunda azalmaya ve doğurganlığın azalmasına neden olur. Dahası, IUHG fetal cinsiyet farklılaşmasını etkiler.

Sonuçlar

IUHG, fare yavrularında fetal gonadal gelişimi ve doğurganlığı bozar

IUHG’nin yavru gonad gelişimini nasıl etkilediğini araştırmak için, pankreas adacıklarını bozmak için gebe farelere STZ enjeksiyonu yaparak bir IUHG fare modeli oluşturduk (Şekil 1a ). STZ’nin farmakokinetiği ve PGC’lerin gelişim süreci göz önüne alındığında, STZ, embriyonik PGC’lerin ortaya çıkmasından önce, gebeliğin 3,5. gününde uygulandı; PGC’ler E6.25 civarında ortaya çıkmaya başladı . ^26. IUHG grubunda enjeksiyondan 3 gün sonra gebelik boyunca korunan yüksek kan şekeri seviyeleri görüldü (Şekil 1b ). Modelin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu doğruladıktan sonra, hiperglisemiye maruz bırakılan dişi yavruların doğurganlığını inceledik. Yavru büyüklüğünde 8 ila 26. haftalar arasında ilerleyici bir azalma gözlemledik; kontrollerle karşılaştırıldığında IUHG’de daha anlamlı bir azalma oldu (Şekil 1c ). Ayrıca, immünohistokimya (IHC) boyama kullanarak çeşitli gelişim aşamalarındaki (E17.5, doğum sonrası 1. gün (P1), P8, 12 haftalık yaş (12 W) ve 32 W) yumurtalık morfolojisini ve oositleri inceledik (Şekil 1d ). IUHG dişi yavrularındaki oosit sayısı, E17.5’ten sonra kontrol grubundakinden önemli ölçüde daha düşüktür ve bu da erken dönemdeki yumurtalık rezervinin azaldığını göstermektedir (Şekil 1e ).

IUHG’nin oosit gelişimini nasıl etkilediğini belirlemek için, dişilerin mayoz bölünmeye girmeye başladığı bir aşama olan E13.5 dişi gonadlarında toplu RNA dizilemesi (toplu RNA-seq) gerçekleştirdik. Temel bileşen analizi (PCA), kontrol ve IUHG dişi gonadları arasında belirgin bir ayrım olduğunu gösterdi (Şekil 1f ), bu da transkriptom üzerinde derin bir etki olduğunu düşündürmektedir. Dahası, IUHG dişi yavrularının E13.5 gonadlarında, kontrollere kıyasla 135 gen önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş ve 166 gen önemli ölçüde aşağı regüle edilmişti (Şekil 1g ). Şaşırtıcı bir şekilde, Gen ontolojisi (GO) analizi, yukarı regüle edilmiş genlerin esas olarak kök hücre popülasyonunun sürdürülmesinde zenginleştiğini (örn., Tfap2c ve Nanog ), aşağı regüle edilmiş genlerin çoğunun ise IUHG E13.5 dişi gonadlarında mayozla ilişkili olduğunu (örn., Mei1 ve Prdm9 ) ortaya koydu (Şekil 1h, i ve Ek Şekil S1 ). Bu bulgular, IUHG’nin fetal gelişim sırasında yumurtalık yapısını belirgin şekilde etkilemeden, öncelikle dişi yavrularında germ hücre gelişimini bozduğunu göstermektedir. Önceki sonuçlarımızla birleştirildiğinde24 ^bu bulgular, IUHG’nin üreme gelişimini PGC aşaması kadar erken etkileyerek her iki cinsiyette de doğurganlığı bozduğunu göstermektedir.

IUHG, özellikle dişilerde E13.5’teki mayoz olmak üzere yavruların PGC gelişimini bozar

Toplu RNA-seq verilerimize göre, germ hücresi gelişimi ciddi şekilde bozulmuştu. IUHG’nin PGC’ler üzerindeki moleküler mekanizmalarını daha fazla araştırmak için, gonadlardaki PGC’leri spesifik olarak etiketleyen Oct4-EGFP transgenik modeli üzerinde deneyler yürüttük ²⁷ . IUHG grubu, E6.5’te STZ enjeksiyonunu takiben 14 mmol/L’yi aşan glikoz seviyeleri sergiledi ve tipik bir IUHG ortamı oluşturdu (Şekil 2a ). Tutarlı bir şekilde, IUHG’nin P1, P8 ve 12 haftalık ovaryumlardan büyüyen oositler de dahil olmak üzere F1 nesli oositler üzerindeki etkileri, transgenik fare suşunda da gözlemlendi (Ek Şekil S2a, b ). P1 ve P8’de, ilkel folikül havuzu oluşturulduğunda, IUHG’deki overler kontrollerden daha az oosit içeriyordu ve bu, IUHG dişilerinde başlangıçtaki over rezervinin azaldığını gösteriyordu (Ek Şekil S2b ). Ek olarak, over ağırlığı 12. haftada IUHG dişilerinde önemli ölçüde daha düşüktü ve buna ilkel foliküllerde artış ve büyüyen foliküllerde azalma eşlik ediyordu (Ek Şekil S2a, b ). Bu sonuçlar, hipergliseminin dişi fetüsler üzerindeki etkisinin farklı fare suşlarında tutarlı olduğunu doğruladı. Ayrıca, IUHG’ye maruz kalan erkek yavruların doğurganlıkta önemli bir düşüş gösterdiğini bulduk (Ek Şekil S2c ). Sperm hareketliliği korunmuş olsa da, sperm konsantrasyonu önemli ölçüde azaldı ve bu, IUHG altında erkek germ hücresi gelişiminin bozulduğunu gösteriyordu (Ek Şekil S2d–f ), bu da önceki çalışmamızla tutarlıydı ²³ . Buna karşılık, toplu RNA-seq, dişi PGC’lerde bozulmuş pluripotens bakımı ve bozulmuş meyotik girişi ortaya koydu (Şekil 1i ). Dişi germ hücreleri rahim içinde E13.5 civarında mayoz bölünmeye başlarken, erkek germ hücreleri doğum sonrası mayoz bölünmeyi başlattığından, bu durum gözlemlenen cinsiyete özgü etkilerin altında yatan neden olabilir.

Daha sonra E12.5’ten E16.5’e kadar embriyo ve germ hücresi gelişimine odaklandık. İlginç bir şekilde, IUHG fetüsleri, E13.5 ve E16.5’te azalmış embriyo ağırlığı ve tepe-kuyruk uzunluğu ile açık bir gelişimsel gecikme gösterdi (Şekil 2b, d ). Oct4-EGFP muhabirini kullanarak, büyüme eksikliklerinin devam ettiği E13.5 ve E16.5’te hem kontrol hem de IUHG embriyolarında PGC’leri ve gonadal morfolojiyi görüntüledik (Şekil 2c, e ). Bu nedenle, IUHG’nin fetal overlerinde mayoz sürecinin gerçekten bozulup bozulmadığını daha fazla belirlemek için, dişi germ hücresinin mayoz’u başlattığı ve sinaptonemal kompleks ²⁶ oluşturduğu bildirilen E13.5’teki kromozom davranışını inceledik . Kontrollerle karşılaştırıldığında, çoğu IUHG oositi bu aşamada profaz I’e girmemişti (Şekil 2f ve Ek Şekil S3a ). Ek olarak, leptoten evresindeki oosit oranı IUHG fetüslerde önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 2g ), bu da potansiyel olarak oosit sayısının azalmasına yol açabilmektedir. Bu sonuçlar, IUHG’nin her iki cinsiyette de fetal PGC gelişimini bozduğunu ve özellikle dişi germ hücrelerinde meiotik başlangıcı bozduğunu göstermektedir.

E13.5 IUHG embriyolarında gözlemlenen germ hücresi sayısının azalmasının nedenini daha iyi açıklamak için, E12.5’ten E13.5’e kadar proliferasyon ve apoptozis dinamiklerini analiz ettik. Ki67 boyama, E12.5’te hem dişi hem de erkek PGC’lerde belirgin şekilde azalmış proliferasyon olduğunu ve bunun hiperglisemi koşulları altında E13.5’e kadar devam ettiğini ortaya koydu (Ek Şekil S3b ), bu da IUHG’nin erken dönemde germ hücresi proliferasyonunu bozduğunu göstermektedir. Kesilmiş kaspaz-3 boyama, E12.5’te apoptozisde belirgin bir artış göstermedi; ancak E13.5’e kadar apoptozis dişi PGC’lerde belirgin şekilde artmıştı, ancak erkeklerde artmamıştı (Ek Şekil S3c ), bu da cinsiyete özgü bir hassasiyet olduğunu düşündürmektedir. Bu sonuçlar, IUHG’nin erken PGC proliferasyonunu baskıladığını ve dişiye özgü apoptozu indüklediğini, bunun da E13.5 IUHG oositlerinde gözlenen gecikmiş meiotik başlangıca katkıda bulunabileceğini göstermektedir.

IUHG’ye maruz kalan dişi PGC’ler gecikmiş pluripotansiyel çıkış ve mayoz başlangıcı sergiler

IUHG’nin PGC’ler üzerindeki moleküler mekanizmasını daha fazla araştırmak için, E12.5, E13.5 ve E16.5 gonadlarından Oct4-EGFP pozitif PGC’leri topladık ve RNA-seq (Smart-seq2) ²⁸ gerçekleştirdik (Şekil 3a ). Oct4-EGFP pozitif PGC’lerin kantifikasyonu, kontrollerle karşılaştırıldığında IUHG gonadlarındaki germ hücre sayısında önemli bir azalma olduğunu gösterdi (Şekil 3b ). STZ’nin potansiyel hedef dışı etkilerini dışlamak için, kan şekeri yükselmemiş STZ enjekte edilmiş gebe farelerden oluşan bir grubu (NonHG grubu) dahil ettik; bu grupta Oct4-EGFP pozitif PGC sayılarında önemli bir fark yoktu (Ek Şekil S4 ). Daha sonra, RNA-seq verilerinin PCA analizi, dişi ve erkek PGC’ler için farklı gelişim yörüngelerini doğruladı (Şekil 3c ). Ek olarak, kontrol ve IUHG PGC’lerinin transkripsiyonunun E12.5’te önemli bir değişiklik göstermediğini bulduk (Şekil 3c ), bu da E12.5’teki karşılaştırılabilir PGC sayısıyla tutarlıdır (Şekil 3b ). E13.5’te dişi PGC’ler önemli transkripsiyonel değişiklikler gösterdi (Şekil 3c , turuncu), erkek PGC’ler ise E16.5’te bile daha az etkilendi. Dişi PGC’lerdeki transkripsiyonel profil E16.5’e kadar kademeli olarak iyileşti (Şekil 3c ve Ek Şekil S5a, b ).

En erken ve en belirgin transkripsiyonel farklılıklar dişi PGC’lerde E13.5’te gözlemlendiğinden, bu aşamada farklı gen ifadesi analizini daha ileri düzeyde yürüttük ve 529 aşağı düzenlenmiş ve 535 yukarı düzenlenmiş geni belirledik (Şekil 3d ve Ek Şekil S5c ). GO analizi, yukarı düzenlenmiş genlerin kromatin yeniden şekillenmesi (örn. Rest , Atrx ve Ctcf ), gen ifadesinin epigenetik düzenlenmesi (örn. Tet1 , Tfap2c ), üreme sistemi gelişimi (örn. Six4 ), p53 sınıfı medyatör tarafından sinyal iletimi (örn. Trp53 , Stk11 ), hücre bölünmesinin düzenlenmesi (örn. Nanog ) ve cinsiyet farklılaşması (örn. Sox2 ) ile ilişkili olduğunu ortaya koydu. Buna karşılık, aşağı düzenlenmiş genlerin çoğunluğu, E13.5 IUHG fetal oositlerde meiotik hücre döngüsü düzenlemesi (örneğin, Dmrtc2 , Stra8 , Sycp1 , Sycp3 ve Tex15 ), germ hücresi gelişimi (örneğin, Mei1 , Tdrd1 ), dişi gamet üretimi (örneğin, Prdm9 , Terb2 ve Msh5 ), oogenez (örneğin, Figla , Dmc1 ), DNA rekombinasyonu (örneğin, Syce3 , Zcwpw1 ), silyum organizasyonu (örneğin, Evi5l , Rab29 ve Ift122 ) gibi süreçlerde zenginleştirildi (Şekil 3e, f ve Ek Şekil S6a, b ). Ayrıca E13.5 IUHG erkek PGC’lerindeki DEG’leri inceleyerek 603 aşağı regüle edilmiş ve 559 yukarı regüle edilmiş gen belirledik; bunlar Wnt sinyal yolu, silium hareketi ve germ hücresi gelişim yollarında önemli zenginleşmeye sahipti (Ek Şekil S6c–f ). Bu nedenle, bu DEG’lerin ifadesindeki değişiklikler spermatogenez sürecini doğrudan etkileyebilir ve sonuçta sperm konsantrasyonunun azalmasına yol açabilir (Ek Şekil S2f ). Bu, IUHG’nin erkek yavrular üzerindeki etkisinin embriyonik aşamada başladığını göstermektedir. Ek olarak, E12.5’te aşağı regüle edilmiş DEG’lerin “BMP sinyal yolu” ve “cinsiyet farklılaşması” ile ilişkili olduğunu, E16.5’te ise hem dişi hem de erkek DEG’lerin öncelikle “gelişimsel süreçlerle” ilişkili olduğunu gözlemledik (Şekil 3e, f ve Ek Şekil S6c, d ). Bu sonuçlar hipergliseminin PGC gelişimi sırasında cinsiyete ve evreye özgü etkiler yarattığını ortaya koymaktadır.

Dikkat çekici bir şekilde, önceki bir çalışma dişi PGC’lerin E13.5 26’da başarılı bir şekilde mayoz bölünmeye girebilmek için normalde pluripotensi durumdan çıkmaları gerektiğini ortaya koydu ^. Bunu temel alarak, DEG’lerimiz arasında iki gen kümesini analiz ettik: 61 pluripotensi ile ilişkili gen ve 66 mayoz ile ilişkili gen (Ek Şekil S6g, h ve Tablolar S 1 , S 2 ), bunlara Enpp3 , Nanog , Sall4 ve Tfap2c gibi önemli pluripotensi belirteçleri ve Dmrtc2 , Mael , Slc25a31 , Stra8 , Sycp1 ve Sycp3 gibi meiotik belirteçler dahildir (Ek Şekil S7a, b ). Bu bulgular, RNA-seq sonuçlarıyla uyumlu olan qPCR ile daha da doğrulandı (Şekil 3g , sağ). E13.5’teki immünofloresan boyama, IUHG dişi PGC’lerinde SALL4’te bir artış ve STRA8 sinyallerinde bir azalma ortaya koydu (Ek Şekil S7c, d ). Özellikle, E13.5 dişi PGC’lerinde pluripotens genlerinin ve mayoz genlerinin yukarı/aşağı düzenlenmesi, E16.5’e geliştiğinde büyük ölçüde geri kazanıldı (Şekil 3g , sol), bu da dişi germ hücrelerinin bir kısmının pluripotent durumdan başarıyla çıkabildiğini ve mayoz bölünmeyi başlatabildiğini göstermektedir. Gelişimsel engeli aşamayan PGC’ler apoptoz sürecine girebilir ve sonunda E13.5 dişi PGC’lerinde p53 sinyal iletimi indüklendiğinde ölebilir (Şekil 3e, f ), bu da E13.5 dişi PGC’lerinin hücre sayısındaki azalmayı açıklayabilir (Şekil 3b ). Buna karşılık, IUHG erkek PGC’leri hem E13.5 hem de E16.5’te pluripotens ve mayozla ilişkili gen ifadesinde minimal değişiklikler gösterdi (Şekil 3g ve Ek Şekil S8 ), bunun nedeni muhtemelen erkek mayozunun doğumdan sonra başlamasıdır. Özellikle, mayozun önemli bir düzenleyicisi olan Stra8 ^12 , 14 , IUHG dişi PGC’lerinde aşağı regüle edilirken, erkek PGC’lerinde E13.5’te yukarı regüle edilir (Şekil 3g ve Ek Şekil S8d ), bu da cinsiyete özgü bir yanıtı vurgular. Dişilerde, azalmış Stra8 ekspresyonu gecikmiş veya bozulmuş mayoz girişini yansıtabilirken, erkeklerde erken yukarı regülasyonu spermatogenez için değişmiş hazırlık yollarını gösterebilir.

PGC’lerdeki gen ifadesi değişimlerinin doğrudan hiperglisemiden kaynaklanıp kaynaklanmadığını araştırmak için, E12.5’ten PGC topladık ve bunları 24 saat boyunca yüksek glikoz altında kültüre ettik (Ek Şekil S9a ). Sonuçlar, 24 saatlik yüksek glikoz tedavisinden sonra hem dişi hem de erkek kültürlerde zayıflamış floresan sinyalleri ve azalmış PGC sayısı gösterdi; bu, in vivo bulgularla tutarlıydı (Şekil 3h ve Ek Şekil S9b, c ). Bu PGC’ler daha sonra qPCR analizi için toplandı. Pluripotens belirteçleri ( Nanog , Sall4 ve Tfap2c gibi ) HG ile tedavi edilen dişi PGC’lerde önemli ölçüde yukarı düzenlenirken, meiotik belirteçler ( Dmrtc2 , Mael , Slc25a31 , Stra8 , Sycp1 ve Sycp3 gibi ) HG ile tedavi edilen dişi PGC’lerde önemli ölçüde aşağı düzenlendi (Şekil 3i, j ). HG ile tedavi edilen erkek PGC’lerde pluripotens genlerinin ifadesi kontrol grubuna kıyasla yukarı düzenlendi ve yukarı düzenlenmiş ifade gösteren Stra8 hariç , mayoz genleri aşağı düzenlendi (Ek Şekil S9d, e ). Bu sonuçlar yine in vivo deneylerle uyumludur. Bu veriler bir araya geldiğinde, IUHG’nin pluripotens ağının anormal bir şekilde korunmasına yol açtığını ve böylece dişi PGC’lerde ancak erkek PGC’lerde değil, mayozun girişini engellediğini göstermektedir. PGC gelişiminde cinsiyete bağlı dimorfik etkiler, öncelikle gelişimsel ilerlemelerindeki farklılıklara bağlanabilir.

IUHG, dişi PGC’lerin kromatin erişilebilirliğini değiştirir

Kök hücre bakımı ve anormal mayoz başlangıcında rol oynayan bu genler hiperglisemi altında nasıl etkilenir? Kromatin erişilebilirliği, gen düzenlemesinde ve hücre farklılaşmasında önemli bir rol oynar. PGC gelişimi sırasında, doğru hücre kaderi belirlemesini sağlamak için kapsamlı kromatin yeniden modellemesi meydana gelir ve bu süreçteki herhangi bir değişiklik, anahtar genlerin uygun ifadesini bozabilir ²⁹ . GO analizi ayrıca, E13.5 IUHG dişi yukarı düzenlenmiş genlerinde “kromatin yeniden modellemesi” ile önemli bir korelasyon gösterdi (Şekil 3f ve Ek Şekil S6b ). Bu nedenle, dizileme (ATAC-seq) kullanılarak Transpozaz Erişilebilir Kromatin Testi için E12.5, E13.5 ve E16.5 PGC’lerinden Oct4-EGFP-pozitif germ hücreleri topladık. Kümeleme sonuçları, her grup için üç biyolojik tekrarlama boyunca yüksek tekrarlanabilirlik gösterdi ve E12.5 ile E13.5 dişi PGC’leri arasında daha önemli bir fark vardı (Ek Şekil S10 ). İlginç bir şekilde, RNA-seq sonucunun aksine, ATAC-seq’in PCA analizi, PGC’lerde E12.5 kadar erken bir zamanda kromatin yapısında önemli farklılıklar ortaya koydu (Şekil 4a ). Bu farklılıklar, E13.5’ten E16.5’e kadar dişi PGC’lerde tutarlı bir şekilde belirgin kalırken, erkek PGC’lerindeki kromatin yapısındaki değişiklikler aynı dönemde nispeten küçüktü (Şekil 4a ). E12.5’te, farklı erişilebilir bölgeler (DAR’lar), IUHG’deki hem güçlendirici hem de promotör bölgelerinde önemli ölçüde değişmeye başladı (Ek Şekil S11a, b ). GREAT (Genomik Bölgelerin Açıklama Zenginleştirme Aracı) GO analizi, blastosist gelişimi ve histon metilasyonunun düzenlenmesinde zenginleştirilmiş IUHG E12.5 PGC’lerinde kapanış güçlendirici DAR’larının analizi. Promotör bölgelerinde ise zenginleştirilmiş işlevler hücre döngüsü DNA replikasyonunu, kromozoma protein lokalizasyonunu, mitotik kardeş kromatit ayrımını, kromatin bakımını ve iğ ipliği kontrol noktasını içeriyordu (Ek Şekil S11c, d ). IUHG E16.5 dişi PGC’lerinde çok sayıda açıcı DAR gözlemlenmesine rağmen, bunlar ilgili terimler altında kümelenmemişti (Ek Şekil S11a, b ). Kontrollerle karşılaştırıldığında IUHG PGC’lerinde açılan DAR’ların yakınında daha fazla DEG bulundu; bu, PGC gelişimi sırasında kromatin yeniden şekillenmesinin kümülatif etkisini yansıtabilir (Ek Şekil S11e ). RNA-seq sonuçlarıyla tutarlı olarak, dişi PGC’ler yüksek glikoz ortamına yanıt olarak erkek PGC’lere göre daha belirgin kromatin değişiklikleri sergilemiştir. Daha da önemlisi, IUHG E12.5 PGC’lerindeki kromatin yapısı, gen ekspresyonu değişikliklerinden daha erken değişmiş ve bu da IUHG’ye bağlı gelişimsel kusurlardaki düzenleyici rolünü göstermektedir.

Kromatin açıklığının gen ifadesiyle yakından ilişkili olduğu bildirildiğinden, önemli pluripotens ve mayozla ilişkili DEG’lerin promotör bölgelerinin kromatin erişilebilirliğini inceledik. Şaşırtıcı bir şekilde, pluripotensle ilişkili DEG’lerin ATAC-seq promotör sinyallerinin IUHG dişi PGC’lerinde E12.5 kadar erken bir zamanda önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini, ancak ifadelerinin önemli değişiklikler göstermediğini gözlemledik (Şekil 3 g, 4b ). Daha sonra E13.5’te meydana gelen en belirgin artış haline geldi (Şekil 4b ). Buna karşılık, mayozla ilişkili DEG’ler E12.5’te kromatin açılmasında gözle görülür bir artış göstermedi (Şekil 4c ), çünkü pluripotensin çıkışı mayozun başlamasının ön koşulu olabilir ³⁰ . Dikkat edilmesi gereken, önceki bir çalışma, DNA metilasyonunun erkek germ hücresi gelişiminde pluripotens programının çıkışı için çok önemli olduğunu ortaya koydu ³¹ . Ancak, tüm genom bisülfit dizileme (WGBS) verilerimize göre (daha sonra tartışılacaktır), pluripotensle ilişkili DEG’lerde belirgin bir azalma göstermemiştir (Ek Şekil S16d ), bu da DNA metilasyonunun tek başına dişi PGC’lerde pluripotensiden anormal çıkışı yönlendiren ana mekanizma olmayabileceğini düşündürmektedir. Bunun nedeni, erkek germ hücrelerinin aksine, dişi PGC’lerin bu gelişimsel dönemde DNA metilasyon rekonstrüksiyonuna başlamaması olabilir ¹⁸ . Özetle, bu sonuçlar, kromatin erişilebilirliği yeniden programlama kusurlarının, ancak DNA metilasyonunun değil, anormal pluripotensin sürdürülmesi ve mayoz başlangıcının düzenlenmesinde temel bir rol oynadığını desteklemektedir.

RNA-seq ve ATAC-seq’i birleştirmek, gen ekspresyonunu kromatin durumuyla ilişkilendirerek gen düzenlemesinin daha derinlemesine anlaşılmasını sağlar. Hem RNA-seq hem de ATAC-seq, E13.5 dişi PGC’lerinde tanımlanan genlerde önemli örtüşme göstermektedir (Şekil 4d ). Özellikle, Enpp3 , Nanog , Sall4 ve Tfap2c gibi pluripotens belirteçlerinin promotör bölgeleri, IUHG dişi E13.5 PGC’lerinde yüksek kromatin erişilebilirliği sergilerken, Dmrtc2 , Mael , Slc25a31 , Stra8 , Sycp1 ve Sycp3 dahil olmak üzere mayozla ilişkili genlerin kromatini, E13.5’te IUHG dişi PGC’lerinde azalmış erişilebilirlik göstermiştir (Şekil 4e, f ). Bu değişiklikler, E13.5’teki IUHG erkek PGC’lerinde gözlenmedi (Ek Şekil S12 ). Bu bulgular, çoklu potansiyelin epigenetik düzenlenmesinde zamansal bir düzensizliğe işaret etmekte olup, bu durum muhtemelen bozulmuş meyotik ilerlemeye katkıda bulunmaktadır.

Gelişmiş Ağlar Tarafından Belirlenen Analiz Algoritması (ANANSE) ve Motif Zenginleştirme Analizi (AME), pluripotens ve meyotik süreçlerde yer alan transkripsiyonel düzenleyicileri tahmin etmek için entegre edildi. Analiz, pluripotens ve meyotik belirteçler tarafından düzenlenen gen sayısıyla birlikte, ilgili gen setlerine yakın tepe noktalarındaki transkripsiyon faktörü (TF) motiflerinin zenginleştirilmesine odaklandı. Bu tahminlere dayanarak, E2f8, Klf12, Patz1 ve Tfdp1 gibi aday pluripotens TF’leri, IUHG dişi PGC’lerinde pluripotensin potansiyel düzenleyicileri olarak tahmin edildi (Şekil 4g, h ve Ek Tablo S 3 ). Özellikle, Patz1 ve Tfdp1 nakavt fareleri, gecikmiş embriyo gelişimi ve azalmış doğurganlık gibi üremeyle ilgili fenotipler sergilemektedir ^32 , 33 . Bu arada, aday mayoz TF’si Tcfl5, IUHG dişi PGC’lerinde mayoz sürecinde rol oynayabilir (Şekil 4i, j ). Tcfl5 eksikliğinin sperm gelişimi ve doğurganlıkta kusurlara yol açan bozuk mayoz’a yol açtığı gösterilmiştir ³⁴ . Farklı durum geçişlerini yönlendiren TF’ler, ANANSE tarafından üretilen etki puanlarına göre sıralandı ve en yüksek etki puanına sahip TF’ler tarandı. E13.5 F’deki durum geçişleri için bazı yönlendiren TF’lerin önceki tahminlerimizle tutarlı olduğu bulundu; bu da sonuçlarımızın güvenilirliğini artırdı (Ek Şekil S13 ). Kromatin erişilebilir bölgelerde pluripotens veya mayoz genleri ile tanımlanmış transkripsiyonel düzenleyiciler arasındaki ilişkiyi daha fazla araştırmak için, E12.5’ten E16.5’e kadar dişi PGC’lerin gelişimi sırasında gen ekspresyonunu ve kromatin erişilebilirlik profillerini entegre ettik (Şekil 4k ). Bu analiz, IUHG dişi E13.5 PGC’lerinde mayoz başlangıcının bozulmasının, muhtemelen pluripotansiyel TF’lerin işgalinin gecikmeli olarak ortadan kaldırılmasından kaynaklandığını göstermektedir. Bu bulgular, gelişim sırasında hiperglisemik ortamda PGC’lerin temel özelliklerinin, kromatin erişilebilirliğinin yeniden yapılandırılmasından doğrudan etkilendiğini göstermektedir.

IUHG’ye maruz kalan germ hücrelerinde epigenetik düzensizliğin mekanizmalarını araştırmak için histon değiştirici enzimleri ve metabolit bağlantılı kofaktörleri inceledik. Dişi PGC’lerde, meiotik kromatin yeniden şekillenmesi sırasında H3K4me3 birikiminin temel düzenleyicileri olan Prdm9 ve Zcwpw1/2’nin belirgin şekilde yukarı regülasyonunu, majör bir histon asetiltransferaz olan Ep300’ün yükselmesiyle birlikte gözlemledik (Ek Şekil S14a ). Gen ifadesiyle tutarlı olarak, H3K4me3 seviyeleri önemli ölçüde azaldı. H3K27ac önemli bir artış göstermedi, ancak bu süreçte diğer histon asetilasyonunun rolünü göz ardı edemedik (Ek Şekil S14b, c ). Enzimlerin ifadesi dışında, metabolik ara ürünler de epigenetik manzaraların düzenlenmesinde önemli roller oynar. α-ketoglutarat (α-KG) ve demetilaz aktivitesi arasındaki iyi bilinen bağlantı göz önüne alındığında ³⁵ , E13.5 PGC’lerinde α-KG’yi ölçtük. Hiperglisemiye maruz kalan dişi grupta α-KG’de önemli bir yükselme gözlemledik (Ek Şekil S15a ), bu da azalmış H3K4me3 seviyeleri ve meiotik genlerde azalmış kromatin erişilebilirliği ile tutarlıdır. α-KG üreten izositrat dehidrogenaz 2 (IDH2) ve onu tüketen oksoglutarat dehidrogenaz (OGDH) ^35 , 36 sırasıyla artma ve azalma eğilimleri gösterdi, ancak P  > 0,05 ile (Ek Şekil S15b ), bu da α-KG birikimini destekleyen metabolik bir kaymayı göstermektedir. Erkek PGC’lerde, majör DNA metilasyon enzimlerinin ifadesi, Dnmt3a’daki ( P  = 0,07) mütevazı bir azalma ve özellikle Tet1’de marjinal öneme sahip Tet1/2/3’ün hafif yukarı regülasyonu (Ek Şekil S15c ) dışında büyük ölçüde değişmeden kaldı; bu, azalan DNA metilasyon seviyesiyle uyumluydu. Benzer α-KG yükselmesi ve artan Idh2 ifadesi gözlemlendi (Ek Şekil S15d, e ), bu da DNA metilasyonunda genel bir azalmayla aynı zamana denk geldi. Bu veriler bir arada, IUHG’nin cinsiyetler arasında belirgin düzenleyici zayıflıklarla metabolik-epigenetik çapraz konuşma yoluyla PGC gelişimini modüle edebileceğini düşündürmektedir.

IUHG’nin fetal oositlerde meiotik ilerleme üzerindeki etkisi devam etmektedir

Transkriptomik ve ATAC-seq verileri, mayozla ilişkili genlerin ifadesinin ve promotör bölgesinin kromatin erişilebilirliğinin E16.5 IUHG’de kademeli olarak normale yakın seviyelere döndüğünü göstermektedir (Şekil 3 g, 4c ). Yavrulardaki mayoz sürecinin gebeliğin sonlarında kalıcı IUHG altında etkilenmeye devam edip etmediğini daha fazla araştırmak için E18.5 oositlerindeki kromozomal davranışı inceledik. Yayılma sonuçları, zigoten aşamasındaki oosit oranının arttığını, pakiten ve diploten aşamalarındakilerin ise kontrol gruplarına kıyasla E18.5 IUHG fetal oositlerinde önemli ölçüde azaldığını göstermiştir (Şekil 5a, b ).

Rekombinasyon ilerlemesinin etkilenip etkilenmediğini değerlendirmek için, kalıcı DNA çift zincirli kopma (DSB) ara maddeleri için bir belirteç olan RPA2’yi inceledik ³⁷ . RPA2 odak seviyeleri zigoten aşamasında gruplar arasında karşılaştırılabilir olsa da, IUHG grubundan pakiten aşamasındaki oositlerde RPA2 odaklarında önemli bir artış gözlemlendi; bu da gecikmiş veya etkisiz DSB onarımını düşündürmektedir (Şekil 5c, d ). Bu sonuçlar, meyotik başlangıcın meydana gelmesine rağmen, hiperglisemi koşulları altında rekombinasyon çözünürlüğünün bozulduğunu göstermektedir. Bununla uyumlu olarak, leptotenden diploten aşamalarına kadar meyotik profazın sürdürülmesi için üç temel gen olan Mlh3 , Mnd1 ve Rec8 ^{38 , 39 , 40} , RNA-seq ve qPCR’mize göre E16.5 fetal oosit IUHG’de orta derecede aşağı düzenlenmiştir (Şekil 5e ). Ayrıca, bölünmüş kaspaz-3 boyama, E16.5’te IUHG’nin yumurtalık dokularında artan apoptozu göstermiştir (Şekil 5f ). Özetle, bu sonuçlar IUHG’nin fetal oositlerde meiotik ilerleme üzerinde sürekli olumsuz bir etki uyguladığını göstermektedir.

IUHG, dişi ve erkek yavruların cinsiyet farklılaşmasını bozar

Cinsiyet farklılaşmasından sonra, dişi ve erkek germ hücreleri farklı gelişim yollarını izler: E13.5’e kadar dişi germ hücreleri kademeli olarak pluripotensilikten çıkar ve mayoz bölünmeye girerken, erkek germ hücreleri pluripotensiyi korur ve doğuma kadar G1/G0 fazında durur ²⁶ . Kanıtlar, dişi germ hücrelerinin cinsiyet belirlenmesinin öncelikle mayozun indüklenmesi veya erkek mayozla ilişkili yolların inhibisyonu tarafından yönlendirildiğini göstermektedir ^41 , 42 . İlginç bir şekilde, erkek ve dişi E13.5 PGC’lerindeki PCA ve DEG’ler ile DAR’ların analizleri, kontrollerle karşılaştırıldığında IUHG altında dişi ve erkek PGC’ler arasındaki farklılıkların azaldığını ortaya koydu (Şekil 6a, b ). GO analizi, cinsiyet farklılaşmasıyla olan korelasyonları daha da vurguladı (Şekil 3f ve Ek Şekil S6b ).

IUHG E13.5 PGC’lerinde, dişi PGC’lerindeki yukarı düzenlenmiş genler erkek tercihli ifade kalıpları gösterirken, erkek PGC’lerindeki yukarı düzenlenmiş genler ise aksine dişi tercihli ifade kalıpları gösterdi (Şekil 6c ). RNA-seq verileri, Foxl2 , Rspo1 ve Wnt4 gibi dişiye özgü genlerin IUHG E13.5 dişi PGC’lerinde aşağı düzenlendiğini ve Cbx2 , Nanos2 ve sox9 dahil olmak üzere erkek özgü genlerin IUHG E13.5 erkek PGC’lerinde aşağı düzenlendiğini göstermektedir (Şekil 6d ). ATAC-seq verilerini dahil ederek, Rspo1 ve Wnt4’ün kromatin erişilebilirliğinin IUHG dişi PGC grubunda E13.5’te azaldığını ve Nanos2’nin kromatin erişilebilirliğinin IUHG erkek PGC grubunda E13.5’te önemli ölçüde azaldığını gözlemledik (Şekil 6e ). Bu, cinsiyet belirleme genlerini düzenlemedeki rolünü doğruladı. qPCR sonuçları, hiperglisemik koşullar altında analiz edilen genler için benzer bir azalmış ifade seviyeleri eğilimi göstererek bulguları doğruladı (Şekil 6f ). Bu bulgular, in vitro yüksek glikoz işlemlerine tabi tutulan kültürlenmiş PGC’lerde doğrulandı (Şekil 6g ). Özellikle, Nanos2 ifadesi IUHG E13.5 erkek PGC’lerinde azalırken, meyotik başlatma geni olan Stra8 önemli ölçüde yukarı düzenlendi (Şekil 6d–g ve Ek Şekiller. S8b , d, S9e ). Bu sonuçlar bir arada değerlendirildiğinde, IUHG’nin dişi farelerde cinsiyet belirleme faktörlerini inhibe ederek veya erkek farelerde mayozla ilişkili gen ekspresyonunu teşvik ederek cinsiyet farklılaşmasını geciktirdiğini göstermektedir.

DNA metilasyonu, açık kromatin yeniden programlaması değil, E16.5’te erkek fare PGC’lerinde ciddi şekilde bozulmuştur

PGC’lerde epigenetik yeniden programlama öncelikle global DNA demetilasyonunun ardından remetilasyonun gerçekleştiği bir döngü ile tanımlanır ¹⁸ . DNA metilasyon yeniden programlaması memeli PGC’lerinin gelişiminde vazgeçilmez bir süreçtir ve genomik baskının silinmesi ve yeniden kurulmasında önemli bir rol oynar ⁴³ . IUHG’nin fetal PGC’lerdeki metilasyon kalıpları üzerindeki etkisini değerlendirmek için her zaman noktasında üç bağımsız örnekte WGBS gerçekleştirdik (Ek Şekil S16a ). Dişi PGC’lerde, E13.5’te gözlemlenen düşük metilasyon seviyeleri E16.5’e kadar korunurken, E16.5’teki erkek PGC’ler tipik olarak önceki çalışmalarla tutarlı olarak güçlü de novo metilasyona uğrar (Şekil 7a ). ^18 , 44 . Global hipometilasyon, muhtemelen doğum sonrası de novo metilasyon nedeniyle, E12.5–E16.5 sırasında dişi PGC’lerde benzer kaldı. Ancak, IUHG E16.5 erkek PGC’lerinde, metilasyon seviyelerinin kontrol grubuyla karşılaştırıldığında yaklaşık %10 oranında azaldığı belirgin bir global hipometilasyon gözlemledik (Şekil 7a ve Ek Şekil S16b, c ). Benzer şekilde, pluripotensle ilişkili ve mayozla ilişkili farklı şekilde metillenmiş bölgelerin (DMR’ler) DNA metilasyon seviyelerinin, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında yalnızca IUHG E16.5 erkek PGC’lerinde önemli ölçüde azaldığını, diğer gelişim aşamalarında kayda değer bir fark tespit edilmediğini gözlemledik (Ek Şekil S16d ).

Ebeveyn kromozomları, ebeveyne özgü gen ekspresyonunu kontrol etmek için DNA metilasyonu tarafından düzenlenen baskı kontrol bölgelerindeki (ICR’ler) spesifik epigenetik imzalarla işaretlenmiştir ⁴⁵ . Bu baskılı lokuslardaki bozulmalar insanlarda ciddi gelişimsel bozukluklara yol açabilir ^46 , 47 . IUHG E16.5 erkek PGC’lerinde, H19 , Zdbf2 , Gtl2 ve Dlk1 gibi baskılı genleri etkileyen, değişmiş DNA metilasyonu ve mRNA ekspresyon desenlerine sahip bir grup ICR belirledik (Şekil 7b–d ve Ek Şekil S16e–g ). IUHG erkek PGC’lerinde, bu ICR’ler ilişkili genlerinin ekspresyonundaki değişikliklerle birlikte önemli ölçüde azalmış metilasyon seviyeleri sergiledi. Bu, uygun ICR metilasyonunun baskılı gen ekspresyonunu sürdürmek için çok önemli olduğunu gösterir. DNA metilasyonunun, spermatogonial kök hücre farklılaşmasının epigenetik programlanmasında ve yaşam boyu spermatogenezin düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir ^31. Bu nedenle, yüksek glikozlu bir ortama maruz kalan fetal erkek PGC’leri, özellikle ICR’lerde DNA metilasyonundaki değişikliklerden etkilenebilir. Bu değişiklikler, pluripotent hücrelerin farklılaşmasını ve doğum sonrası mayoz sürecini bozarak spermatogenezi bozabilir ve nihayetinde bir sonraki nesli etkileyebilir.

Tartışma

Doğurganlık sorunları, birden fazla faktör tarafından yönlendirilen küresel zorluklardır ⁴⁸ . GDM gibi IUHG’lerin artan yaygınlığı, anne ve çocuk sağlığı için zorluklar oluşturmaktadır ^{49 , 50 , 51} . Artan kanıtlar, özellikle yavruların üreme sistemlerinde IUHG ile ilişkili olumsuz sonuçları vurgularken ⁵² altta yatan mekanizmalar daha fazla araştırmayı beklemektedir. Bu çalışmada, IUHG’nin cinsiyete özgü yollarla fetal germ hücre gelişimini nasıl etkilediğini ortaya koyduk (Şekil 7e ). Kısaca, doğrudan IUHG’ye maruz kalan yavru embriyoları, E12.5 PGC’lerinde bozulmuş kromatin yeniden şekillenmesi sergiledi. Dişi yavrularda, IUHG PGC’leri, öncelikle pluripotent transkripsiyonel programı baskılayamamaları ve mayoz başlatamamaları nedeniyle E13.5 ve E16.5 arasında gelişimsel gecikmeler sergiler ve bu da en sonunda oositlerin yumurtalık rezervinin azalmasına ve doğurganlığın azalmasına yol açar. Bu gecikme büyük ölçüde pluripotensi genlerindeki bozulmuş kromatin erişilebilirliğine, gen ifadesi değişikliklerinden önce, E12.5 kadar erken bir zamanda atfedilir. Erkek yavrularında, IUHG grubu önemli ölçüde azalmış sperm konsantrasyonuyla sonuçlanır. Dişilerin aksine, erkek PGC gelişimi sırasında bozulmuş DNA metilasyonu yeniden programlaması gözlemlendi. IUHG’ye maruz kalan hem erkek hem de dişi yavrular, muhtemelen sırasıyla PGC’lerde DNA metilasyonu ve kromatin yeniden modellemesindeki değişiklikler yoluyla, bozulmuş doğurganlık sergilediler. Değişikliklerin bazıları olgun gametlere geçebilir ve nesiller arası etkiler gösterebilir; bu durum GDM kaynaklı epigenetik değişikliklerin F2 nesline kadar devam edebileceğini gösteren önceki çalışmalarla uyumludur ^21 , 24 . F1 PGC’lerinde E13.5 kadar erken bir zamanda tespit edilebilen bu kalıtsal değişiklikler, IUHG’nin bozulmuş germ hattı epigenetik yeniden programlaması yoluyla nesiller arası etkiler gösterebileceğini düşündürmektedir.

IUHG, dişi ve erkek PGC’lerinde belirgin epigenetik değişikliklere neden olur. Bu değişiklikler, dişilerde kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikler ve erkeklerde baskın olan DNA metilasyon değişikliklerinin görülmesiyle karakterize edilir. Bu farklılıklar, erkek ve dişi PGC’lerinin benzersiz gelişimsel zaman çizelgelerine atfedilebilir ²⁶ . Dişi PGC’leri, bu gelişimsel aşamada metabolik bozulmalara karşı daha hassas olabilen dinamik kromatin yeniden şekillenmesini gerektiren bir süreç olan mayoz bölünmeyi daha erken başlatır ²⁹ . Buna karşılık, erkek PGC’leri, hiperglisemi kaynaklı metabolik stresin kritik pencereleriyle çakışan bir aşama olan mitotik durma sırasında önemli bir DNA metilasyon yeniden programlamasından geçer ¹⁸ . Dahası, farklılaşma sırasında PGC’lerin cinsiyete özgü metabolik durumlarının bu farklı epigenetik sonuçlara katkıda bulunması düşünülebilir. Hipergliseminin, glikoliz, trikarboksilik asit döngüsü ve tek karbon metabolizması yolu dahil olmak üzere önemli metabolik yolları bozduğu bilinmektedir ⁵³ . Bu bozulmalar, DNA ve histon değiştirici enzimler için kofaktör veya substrat görevi gören S-adenosilmetionin, asetil-CoA ve α-KG gibi önemli metabolitlerin bulunabilirliğini etkileyebilir ⁵⁴ . E12.5’ten E16.5’e kadar olan intrauterin pencere sırasında, IUHG maruziyetinin hem erkek hem de dişi E13.5 PGC’lerinde α-KG seviyelerinde ve α-KG ile ilişkili metabolik enzimlerin ifade modellerinde benzer değişikliklere neden olduğunu bulduk. α-KG’nin hem histon hem de DNA demetilazlardaki çok yönlü rolleri göz önüne alındığında, işlevsel özgüllüğü muhtemelen germ hücrelerinin gelişim aşamasına ve epigenetik yeniden programlanmasına bağlıdır. Özellikle, mayoz’u başlatan ancak henüz de novo DNA metilasyonuna başlamamış ve bu nedenle hipometile durumda kalan dişi PGC’lerinde, yüksek α-KG seviyesi öncelikle H3K4me3 birikimini bozabilir. Özellikle, PRDM9’a bağlı H3K4me3, meyotik giriş ve DSB oluşumu için gereklidir ve indirgenmesi, gözlemlenen meyotik kusurlara doğrudan katkıda bulunabilir (Şekil 5a ve Ek Şekil S14 ). Buna karşılık, bu aşamadaki erkek PGC’ler kapsamlı remetilasyona uğramaktadır ancak henüz mayoz bölünmeyi başlatmamışlardır. Bu bağlamda, artan α-KG, TET enzimlerinin aktivitesini öncelikli olarak artırabilir ve bu da bozulmuş DNA remetilasyonuna yol açabilir (Şekil 7a ve Ek Şekil S15c, d). Bu cinsiyete özgü etkiler, metabolik durum ile epigenetik yeniden şekillenme arasındaki etkileşimin germ hücresi gelişim zamanlamasıyla nasıl sıkı bir şekilde koordineli olduğunu vurgular. Bulgularımız, maternal hipergliseminin yavru germ hattı gelişimi üzerindeki zararlı etkilerinin aracılık edilmesinde metabolik-epigenetik eksenin önemli bir rolü olduğunu ortaya koyarken, bu süreçte ek metabolik ara maddelerin ve epigenetik düzenleyicilerin rolünü göz ardı edemeyiz. Metabolik değişiklikleri kromatin değiştiren enzim aktivitesine ve kromatin erişilebilirliğindeki değişikliklere bağlayan kesin moleküler mekanizmaların henüz tam olarak anlaşılmadığını kabul ediyoruz. Özellikle, PGC’lerin kıtlığı ve teknik hassasiyetteki mevcut kısıtlamalar gibi teknik sınırlamalar, nadir hücre popülasyonlarında metabolitlerin doğrudan profillenmesinde önemli zorluklar yaratmaktadır. Bu tür bağlamlarda küresel metabolik durumların hassas bir şekilde ölçülmesini sağlamak için güçlü, ultra düşük girdili veya hatta tek hücreli metabolomik yaklaşımların geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır.

IUHG’nin güncel klinik yönetimi öncelikle maternal kan glukozunu hedef alır ve yaşam tarzı müdahaleleri, insülin tedavisi veya oral hipoglisemik ajanlar yoluyla genel glukoz metabolizmasını iyileştirir ⁵⁵ . Bu stratejiler maternal ve perinatal komplikasyonları azaltabilirken, IUHG’nin yavrular üzerindeki uzun vadeli üreme etkilerini hafifletme yetenekleri belirsizliğini korumaktadır ⁵⁶ . İnsan fetal germ hücreleri kullanılarak yapılan doğrudan doğrulama etik ve lojistik zorluklarla sınırlı olsa da, yakın tarihli klinik çalışmalar GDM gebeliklerinden alınan plasenta ve kordon kanı örneklerinde cinsiyete özgü epigenetik ve transkriptomik değişiklikler bildirmiştir ^{57 , 58 , 59} . Bu değişiklikler metabolik ve hormonal yollarda zenginleştirilmiştir ve erken, cinsiyete özgü fetal programlamayı düşündürmektedir. Bu bulgular birlikte, fare gözlemlerimiz için translasyonel destek sağlamakta ve IUHG’nin uzun vadeli etkilerinin aracılık edilmesinde epigenetik mekanizmaların önemini vurgulamaktadır.

Hastalıkların moleküler mekanizmalarını daha iyi açıklamak için PGC’lerin gelişimini incelemek çok önemlidir. Bulgularımız, IUHG’nin gelişmekte olan germ hücrelerindeki önemli epigenetik süreçleri bozmadaki potansiyel rolünü göstermektedir. Bugüne kadar, IUHG’den etkilenen yavrularda epigenetik homeostazın veya üreme sistemi gelişiminin restorasyonunu doğrudan hedefleyen spesifik farmakolojik veya nonfarmakolojik müdahaleler yoktur. Tek karbon metabolizması ve asetil-CoA yolları gibi epigenetik modifikasyonlarla bağlantılı metabolik yolaklar, potansiyel terapötik hedefler olarak hizmet edebilir ⁶⁰ . Gelecekteki müdahale stratejileri, diyet takviyelerini (örneğin, folat, B12 vitamini veya asetil donörleri), epigenetik enzimlerin farmakolojik modülatörlerini veya spesifik kromatin yeniden şekillendirme kusurlarını düzeltmek için tasarlanmış küçük molekülleri içerebilir ^61 , 62 . Çalışma germ hücrelerindeki epigenetik değişiklikleri belirlerken, hipergliseminin bu değişiklikleri nasıl yönlendirdiği kesin mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışma, IUHG yönetiminde, anne glikoz kontrolünün ötesine geçerek yavru sağlığı için hedefli müdahaleleri de kapsayacak bir paradigma değişimine ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. Klinik tedavi hedeflerine ulaşmak için PGC’leri hedef alan müdahaleler, daha fazla araştırma konusu olmaya devam etmektedir. Sonuç olarak, çalışmamız, IUHG’ye maruz kalan fetal PGC’lerdeki gelişimsel, transkripsiyonel ve epigenetik değişiklikler hakkında değerli bilgiler sunmaktadır.

Malzemeler ve yöntemler

Bir fare modelinin oluşturulması

Tüm hayvan deneyleri Fudan Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler, sabit bir sıcaklık (20-25 °C) ve nem seviyelerinde (%30-%70) 12 saat ışık ve 12 saat karanlık döngüsünde tutulmuştur. Annede obezite veya gebelik öncesi diyabet gibi karıştırıcı faktörleri en aza indirirken gebelik hiperglisemisini özel olarak modellemek için, gebeliğin 3,5. gününde diyabet oluşturmak için STZ (Sigma) kullandık. STZ, kısa yarı ömrü sayesinde pankreas β hücrelerini hızla ve seçici bir şekilde yok ederek hiperglisemi başlangıcının hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. Daha da önemlisi, kan şekeri yükselmemiş STZ enjekte edilen dişilerde fetal germ hücresi fenotipi görülmemiştir ve bu da gözlemlenen etkilerin STZ’nin kendisinden ziyade hiperglisemiye atfedilebileceğini doğrulamaktadır. Ayrıntılı prosedürler aşağıda açıklanmıştır. Sekiz haftalık dişi fareler, vahşi tip veya Oct4 – EGFP erkek farelerle çiftleştirilmiştir. Ertesi sabah vajinal tıkacın varlığı, gebeliğin E0,5’i olarak tanımlanmıştır. Gebe fareler rastgele kontrol grubu ve intrauterin üreme (IUHG) olmak üzere iki gruba ayrıldı. 12 saatlik açlıktan sonra, IUHG’deki farelere gebeliğin 3,5. gününde intraperitoneal olarak 120 mg/kg vücut ağırlığı dozunda STZ enjekte edildi. Gebeliğin 6,5. gününde, kan şekeri konsantrasyonu kuyruk damarından bir glukometre (Roche Diagnostics Accu-Chek, Almanya) kullanılarak ölçüldü. Diyabet için dahil etme kriteri olarak 14 mM’nin üzerinde bir kan şekeri seviyesi kullanıldı. Diyabetin varlığını ve ilerlemesini doğrulamak için doğum öncesi dönem boyunca kan şekeri seviyeleri izlendi.

Fetus toplama ve PGC izolasyonu

Çiftleşmeden sonra, vajinal tıkacın varlığına göre E0.5 olarak tanımlandı. E12.5, E13.5, E16.5, E17.5 ve E18.5 günlerinde gebe fareler servikal dislokasyonla insani bir şekilde ötenazi edildi ve embriyolar istatistiksel fenotipleme ve sonraki deneyler için toplandı. Doğumdan sonra, farklı yaşlardaki (P1, P8, 12 W, 32 W) dişi farelerin yumurtalıkları ve erkek farelerin (8 haftalık) testisleri daha ileri analiz için toplandı.

Embriyonik gonadlar E12.5, E13.5 ve E16.5’te toplandı ve dişi ve erkek gonadlar Sry-primer PCR tanımlaması veya belirgin morfolojik özellikler ile ayırt edildi. PCR, aşağıdaki primerler kullanılarak gerçekleştirildi: ileri: ATTTATGGTGTGGTCCCGTGGTGAG; geri: GTATGTGATGGCATGTGGGTTCCTG. Gonadlar, 37 °C’de 5 dakika boyunca %0,25 tripsin-EDTA kullanılarak tek hücre süspansiyonlarına enzimatik olarak sindirildi. Elde edilen hücreler, EGFP pozitifliğine göre bir BD FACS Aria II akış sitometresinde sıralandı. PGC’ler, ATAC-seq için doğrudan PBS’ye ayrıldı veya sonraki RNA-seq ve WGBS için sıvı nitrojende lize edildi ve hemen donduruldu.

IHC

Taze fare yumurtalık dokuları %4 paraformaldehit ile fiksasyona tabi tutuldu ve optimum kesme sıcaklığına sahip bir bileşiğe (Sakura, 4583) gömüldü. En büyük kesitin (yumurtalık merkezi) yakınındaki seri kesitler, 5 μm’de bir mikrotomla kesilerek sayıldı (Leica, CM 1950). Örnekler rutin prosedürlere tabi tutuldu. Kesitler, Anti-MVH (Abcam, ab284611) ile inkübe edildi.

Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama

Fare yumurtalığı ve testisinden alınan taze örnekler, 4 °C’de bir gece boyunca %4 paraformaldehit içinde fiksasyona tabi tutuldu. Örnekler dehidrate edildi ve parafine gömüldü. Bir mikrotom, örnekleri 5 μm kalınlığında (Leica, CM 1950) bir mikrotomla kesti. Kesitler rutin olarak deparafinize edildi ve standart protokollere göre H&E ile boyandı.

Yumurtalık foliküllerinin kantifikasyonu

Yumurtalık foliküllerinin miktar tayini, yerleşik protokoller izlenerek gerçekleştirildi ^63. Parafine gömülmüş yumurtalıklar 5 μm kalınlığında seri olarak kesildi ve morfolojik değerlendirme için IHC veya H&E boyama kullanılarak analiz edildi. IHC analizi için, en büyük yumurtalık kesitine (ortada) yakın seri kesitler hazırlandı ve dördüncü kesit yumurtalık foliküllerini saymak için incelendi. H&E boyama için, primordial, primer (tip 3 ve tip 4), pre-antral (tip 5) ve antral foliküller (tip 6 ve tip 7) dahil olmak üzere farklı gelişim evrelerindeki foliküller, bir yumurtalık boyunca her beşinci kesitte tanımlandı ve miktarları belirlendi. Bu sınıflandırma, Pederson ve Peters tarafından açıklanan iyi bilinen kriterlere dayanıyordu ^64. Her kesitte yalnızca görünür bir oosit çekirdeği olan foliküller sayıldı. Bir yumurtalıktaki toplam folikül sayısını tahmin etmek için, kümülatif sayımlar 5’lik bir düzeltme faktörüyle çarpıldı.

Kromozom yayılımları

Kromozom yayılımı için deneysel protokol daha önce açıklandığı gibi yürütüldü ^65. E13.5 ve E18.5 fare embriyolarından alınan diseke edilmiş yumurtalık dokuları hipotonik bir solüsyona (17 mM trisodyum sitrat dihidrat, 50 mM sukroz, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, 0.5 mM proteaz inhibitörü PMSF, pH 8.2) yerleştirildi ve 37 °C’de 15 dakika kültüre edildi. Bir stereo mikroskop altında forseps kullanılarak, yumurtalıklar 100 mM sukroz solüsyonunda (pH 8.2) yavaşça dağıtıldı. Son olarak, hücre süspansiyonu yapışkan slaytlara uygulandı ve nemlendirilmiş bir odada %1 paraformaldehit (0.2% Triton X-100 içeren) solüsyonunda 2 saat sabitlendi. Kurutulduktan sonra, slaytlar kısa süreli koruma için -80 °C’de saklanabilir ve sonraki deneylerde kullanılabilir. Slaytlar 15 dakika boyunca %0,5 Triton X-100 solüsyonuna daldırıldı, ardından oda sıcaklığında %5 BSA solüsyonu ile 1 saat bloke edildi ve primer antikorlarla (Anti-SYCP1: Abcam, ab303520; Alexa Fluor®488 Anti-SYCP3: Santa, sc-74569; RPA2: Abcam, ab76420) 4 °C’de bir gece boyunca boyandı. Slaytlar, her biri 5 dakika olmak üzere üç kez PBS ile yıkandı ve ardından sekonder antikorla (Anti-Cy3: Abcam, ab6939) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. Daha sonra, slaytlar her biri 5 dakika olmak üzere üç kez PBS ile yıkandı ve ardından kurutuldu ve monte edildi. Son olarak, slaytlar lazer konfokal mikroskop (Nikon ECLIPSE Ti2, Japonya) kullanılarak görüntülendi ve veriler Nikon NIS yazılımı ile istatistiksel analize tabi tutuldu.

Embriyonik gonadların immünofloresan boyama

Fare gonadları E12.5, E13.5 ve E16.5 noktalarından diseke edildi ve ardından 4 °C’de %4 paraformaldehit içerisinde fiksasyon uygulandı. Fiksasyondan sonra dokular %30’luk sakaroz içerisinde dehidrate edildi, OCT bileşiğine (Sakura) gömüldü ve bir kriyomikrotom (Leica, CM 1950) kullanılarak 10 μm kalınlığında kesitler alındı. İmmünofloresan boyama için kesitler, primer antikorlarla (Ki67: Abcam, ab16667; Cleaved caspase-3: Cell Signaling Technology, 9661S; SALL4: PPMX Perseus Proteomics, PP-PPZ0601-00; STRA8: Abcam, ab49602; EGFP: Abcam, ab13970; H3K4me3: Cell Signaling Technology, 9751 T; H3K27ac: Abcam, ab4729) inkübe edildi, ardından uygun florofor konjuge sekonder antikorlar (Anti-Cy3: Abcam, ab6939 ve ab97035; Anti-488: Abcam, ab150173) eklendi. Görüntüler konfokal lazer tarama mikroskobu (Nikon ECLIPSE Ti2, Japonya) kullanılarak alındı.

Toplu RNA-seq ve veri analizi

Toplam RNA, E13.5’te dişi gonadlardan (örnek başına 4 çift dişi gonad, her grup için 3 örnek) Universal RNA Extraction CZ Kit (RNC643, ONREW) ile üreticinin talimatlarına göre çıkarıldı. Toplu RNA-seq kütüphanesi yapımında kullanılan örnekler Ek Tablo S 4’te listelenmiştir . RNA kalitesi Qubit 4.0 (Invitrogen) kullanılarak analiz edildi ve kalite denatüre edici agaroz jel üzerinde elektroforezle incelendi. RNA kütüphaneleri, Illumina için VVAHTS® Universal V8 RNA-seq Kütüphane Hazırlık Kiti (NR605-0, Vazyme) kullanılarak hazırlandı ve ardından 150 çift uçlu dizileme stratejisiyle Illumina NovaSeq 6000 platformu kullanılarak dizilendi. mRNA zenginleştirme, kütüphane yapımı, dizileme ve veri analizi Shanghai Xu Ran Biotechnology Co., Ltd. tarafından gerçekleştirildi.

Ham toplu RNA-seq verileri FastQC (v0.12.1) ile kalite kontrolünden geçirildi ve Trim Galore (v0.6.10) kullanılarak adaptörler ve düşük kaliteli bazlar için kırpıldı. Temiz okumalar, HISAT2 (v2.2.1) kullanılarak fare genomuna (mm9) hizalandı ve sıralanmış BAM dosyaları SAMtools (v1.6) ile oluşturuldu. Gen düzeyinde ham sayımlar ve FPKM’ler elde etmek için GTF açıklamasıyla yönlendirilen transkript birleştirme ve kantifikasyonu için StringTie (v2.1.7) kullanıldı. Diferansiyel ifade analizi DESeq2 R paketi (v1.42.1) kullanılarak gerçekleştirildi. Toplam 10’dan az sayımı olan genler hariç tutuldu ve normalizasyon, oranların medyanı yöntemi kullanılarak uygulandı. Deneysel koşulu (IUHG’ye karşı Kontrol) içeren bir tasarım formülü belirtildi. DESeq2 boyut faktörlerini ve dispersiyonları tahmin etti ve negatif binom dağılımına dayalı Wald testleri gerçekleştirdi. FDR ayarlı P  < 0,05 ve |log₂ kat değişimi| ≥ 1 olan genler farklı şekilde ifade edilmiş olarak kabul edildi. DEG’ler ggplot2 ve pheatmap kullanılarak görselleştirildi ve sonraki yol analizinde kullanıldı.

Gen Seti Varyasyon Analizi (GSVA) ​​analizi, toplu RNA-seq verilerinden türetilen FPKM ekspresyon matrisi üzerinde gerçekleştirildi ^66. Örnekler genelinde en değişken ilk 10.000 gen analiz için saklandı. KEGG ve GO Biyolojik İşlem yollarına karşılık gelen gen setleri Moleküler İmzalar Veritabanından (MSigDB, koleksiyonlar: m5.go.v2024.1.Mm.symbols.gmt) indirildi ^67. GSVA puanları, varsayılan parametrelerle GSVA R paketindeki (sürüm 1.50.5) “gsva()” işlevi kullanılarak hesaplandı. Deney grupları arasındaki diferansiyel yol aktivitesi limma paketi kullanılarak değerlendirildi.

RNA-seq (Smart-seq2) ve veri analizi

Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre Evrensel RNA Ekstraksiyon CZ Kiti (RNC643, ONREW) ile fetal PGC’lerden (E12.5, E13.5 ve E16.5’ten toplanan; örnek başına 20-30 fetüs, her grup için 3 örnek) çıkarıldı. RNA-seq kütüphanesi oluşturmak için kullanılan örnekler Ek Tablo S 4’te listelenmiştir . RNA miktarı Qubit 4.0 (Invitrogen) kullanılarak analiz edildi ve kalitesi denatüre edici agar jel üzerinde elektroforezle incelendi. Toplam RNA, girdi materyali olarak kullanıldı. cDNA sentezi ve amplifikasyonu Tek Hücreli Tam Uzunlukta mRNA-Amplifikasyon Kiti (N712-03, Vazyme) ile ve saflaştırma VAHTS DNA Temiz Boncuklar (N411-02, Vazyme) ile gerçekleştirildi. Dizileme kütüphaneleri, TruePrep® DNA Kütüphane Hazırlık Kiti V2 (TD502-02, Vazyme) kullanıcı kılavuzu izlenerek hazırlandı. Dizileme, 150 çift uçlu dizileme stratejisine sahip Illumina Novaseq 6000 platformu kullanılarak gerçekleştirildi. mRNA kütüphanesinin zenginleştirilmesi ve dizilenmesi, Shanghai Xu Ran Biotechnology Co., Ltd. tarafından gerçekleştirildi.

RNA-seq veri kalitesi değerlendirmesi FastQC kullanılarak gerçekleştirildi. Adaptörler ve düşük kaliteli dizileme okumaları Trim Galore kullanılarak kaldırıldı. Filtrelenen dizileme okumaları, STAR iki geçişli eşleme modu ⁶⁸ kullanılarak fare referans genomuna (Mm39) hizalandı . Sonraki analizler için yalnızca benzersiz şekilde eşlenen okumalar saklandı. Diferansiyel gen ekspresyonu analizi için featureCounts aracı ⁶⁹ , bir gen ekspresyonu kantifikasyon matrisi oluşturdu ve ardından R paketi DESeq2 ⁷⁰ kullanılarak, eşikler mutlak katlama değişimi > 2 ve P < 0,01 olarak ayarlanarak diferansiyel ekspresyon analizi gerçekleştirildi. GO zenginleştirme analizi, clusterProfiler ⁷¹ ve fare açıklaması org.Dr.Mm.db  kullanılarak gerçekleştirildi ve  sunum için biyolojik süreçler P < 0,05 ile korundu.

RNA izolasyonu ve qPCR

Toplam RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezleme protokolleri, RNA dizileme bölümüne atıfta bulunuldu. qPCR, sistem için üretilen ticari primerlerle QuantStudio 5 (Life Technologie) kullanılarak gerçekleştirildi. Hedef genlerin ekspresyonu, referans genin ( Gapdh ) ekspresyonuna göre normalleştirildi. Bu çalışmada kullanılan primerler Ek Tablo S 5’te listelenmiştir .

Yüksek glikozlu kültürlü E12.5 PGC’lerin in vitro genişlemesi

PGC kültürü, önceki raporda açıklanan yönteme göre gerçekleştirildi ⁷² . Kısaca, Oct4-EGFP transgenini taşıyan E12.5 gonadları (erkek ve dişi) diseke edildi ve tek hücreli bir süspansiyona sindirildi. Hücre karışımı, kontrol grubu olarak GMEM’de (10% KSR, 0,1 mM NEAA, 1 mM sodyum piruvat, 0,1 mM 2-merkaptoetanol, 100 U/mL penisilin, 0,1 mg/mL streptomisin, 2 mM L-glutamin, %2,5 FBS, 100 ng/mL SCF, 10 μM Forskolin ve 10 μM Rolipram içeren) kültüre edildi. HG ile tedavi edilen grupta, ortama 25 mM susuz glikoz eklendi ²² . 24 saatlik in vitro kültürden sonra PGC’ler ayrıştırıldı ve FACS ile analiz edildi.

ATAC-seq ve veri analizi

FACS ile elde edilen EGFP pozitif PGC’ler PBS ile yıkandı. ATAC-seq, Hiperaktif ATAC-Seq Kütüphane Hazırlık Kiti kullanılarak gerçekleştirildi. Özetle, 5000-10.000 hücre toplandı ve lizis tamponu kullanılarak lize edildi. DNA çıkarıldı ve dizileme için kütüphaneler oluşturmak üzere 15 döngü boyunca çoğaltıldı. ATAC-seq kütüphaneleri Illumina platformunda (Illumina, ABD) dizilendi. Üç biyolojik tekrar analiz edildi. ATAC-seq kütüphanesi oluşturmak için kullanılan örnekler Ek Tablo S 6’da listelenmiştir .

Ham verilerden adaptörler ve düşük kaliteli dizileme parçaları Trim Galore kullanılarak çıkarıldı. İşlenen dizileme okumaları, Bowtie2 kullanılarak fare referans genomuna hizalandı. Picard MarkDuplicates ( http://broadinstitute.github.io/picard/ ) kullanılarak yinelenen dizileme okumaları elendi ve mitokondriye eşlenen okumalar da çıkarıldı. Tn5 transpozaz kesme özellikleri nedeniyle, filtrelenmiş okumalar pozitif iplikçik için + 4 bp ve negatif iplikçik için – 5 bp kaydırıldı. Daha sonra, ATAC-seq tepeleri MACS2 ⁷³ kullanılarak aşağıdaki parametrelerle tanımlandı : -q 0.01 –shift -75 –extsize 150 –nomodel –keep-dup all –call-summits. Normalize edilmiş ATAC-seq sinyali, -binSize 10 –normalizeUsing RPKM -extendReads parametreleriyle bamCoverage kullanılarak üretildi. Çeşitli gelişim aşamalarındaki DAR’lar , FDR < 0,001 olanlar daha ileri analiz için saklanarak DiffBind ^{74 kullanılarak tanımlandı.}

Anahtar TF’lerin belirlenmesi

^{Anahtar TF’ler, ANANSE 75} ve AME ⁷⁶ araçları kullanılarak tahmin edildi . Pluripotensi ve mayozla ilişkili genler, GO veritabanından indirildi ve ilgi çekici genler olarak tanımlandı. Bir kriter, ANANSE tarafından tahmin edilen TF’ler tarafından düzenlenen bu hedef genlerin sayısıydı. Bir diğer kriter ise, AME tarafından tanımlanan, ilgi çekici genlerin yakınındaki epigenetik olarak dinamik bölgelerde zenginleştirilmiş TF bağlanma motiflerini içeriyordu. Her iki kritere göre de üst sıralarda yer alan TF’ler, anahtar TF’ler olarak tanımlandı.

α-KG ölçümü

E13.5’teki gonadlardan örnekler alındı. α-KG, üreticinin talimatları izlenerek bir α-KG analiz kiti (MET-5131, Cell Biolabs) ile ölçüldü. Kolorimetrik sinyal, Elx808 mikro plaka okuyucu cihazı kullanılarak okundu; elde edilen değerler (biyolojik tekrar başına iki teknik tekrar), toplam protein özütü üzerinden normalize edildi; grup başına n  = 4 biyolojik tekrar, her biri 20-30 çift gonaddan oluşuyordu.

WGBS ve veri analizi

FACS ile elde edilen EGFP-pozitif PGC’ler PBS ile yıkandı. DNA, hücrelerden QIAamp® DNA Mikro Kiti (QIAGEN) kullanılarak izole edildi. Genomik DNA, üreticinin talimatları doğrultusunda EpiArt® DNA Metilasyon Bisülfit Kiti (Vazyme) kullanılarak bisülfit dönüşümüne tabi tutuldu. Dizileme için kütüphaneler, EpiArt® DNA Metilasyon Kütüphane Kiti ile 100-200 ng genomik DNA kullanılarak hazırlandı. Kütüphaneler, 100-200 bp arasındaki DNA parçaları için saflaştırıldı. Kütüphane kalitesi, Agilent 5400 sistemi (Agilent, ABD) üzerinde değerlendirildi ve ardından PCR sistemi ile çoğaltıldı. Örneklerin çift uçlu dizilenmesi Illumina platformunda (Illumina, ABD) gerçekleştirildi. Üç biyolojik tekrar analiz edildi. WGBS kütüphanesi inşasında kullanılan örnekler Ek Tablo S 7’de listelenmiştir .

^{WGBS’den alınan ham dizileme okumaları, entegre metilpy yazılım paketi 77} kullanılarak işlendi . İlk olarak, metilpy bisülfit dönüştürülmüş genom dizisini indeksledi ve hizalama, hizalama aracı olarak Bowtie2 kullanılarak eşleştirilmiş uç modunda gerçekleştirildi. Ardından, metilpy içindeki çağrı-metilasyon-durum fonksiyonu, genomdaki tüm sitozinlerin metilasyon durumunu hesaplamak için kullanıldı. Son olarak, farklı örneklerden alınan biyolojik tekrarlar daha ileri analiz için birleştirildi.

DMR’leri tanımlamak için, tüm örneklerdeki CG DMR’lerini tespit etmek üzere metilpy’deki DMRfind fonksiyonunu kullandık. Özetle, DMRfind, DMS’leri tanımlamak için permütasyon tabanlı bir ortalama karekök uyum testi kullanır. 250 bp içindeki DMS’ler DMR’lerle birleştirildi. FDR < 0,01 olan DMR’ler ve en az beş DMS, sonraki analizler için saklandı. Daha sonra, promotörler ve güçlendiriciler gibi işlevsel bölgelerdeki varlıklarını belirlemek için DMR’leri fare genom açıklamalarıyla hizalayarak açıklamak için ChIPseeker ^{78 kullanıldı.}

DNA metilasyonunun gen ifadesi üzerindeki etkisini araştırmak için, gen ifadesi kantifikasyonu (FPKM) için StringTie ^{79 kullanıldı. Genler, ifade düzeylerine göre üç gruba ayrıldı ve her grup yüksek, orta ve düşük ifadeye sahip 3000 gen içeriyordu. Her grup için düzenleyici bölgelerdeki (transkripsiyon başlangıç ​​bölgelerinin 5 kb yukarısında, gen gövdelerinde ve transkripsiyon bitiş bölgelerinin 5 kb aşağısında) DNA metilasyon düzeyleri, DeepTools 80’deki} ComputeMatrix ve plotProfile işlevleri kullanılarak görselleştirildi .

İstatistiksel analiz

Tüm analizler SPSS yazılım sürümü 26 (Chicago, IL, ABD) ve GraphPad Prism sürüm 7 kullanılarak gerçekleştirildi. İstatistiksel karşılaştırmalar Student t -testi kullanılarak yapıldı. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu. Tüm deneyler en az üç kez bağımsız olarak tekrarlandı. P  < 0,05, istatistiksel olarak anlamlı değişiklikler olarak kabul edildi (* P  < 0,05, ** P  < 0,01, *** P  < 0,001, ns, anlamlı değil). RNA-seq, ATAC-seq ve WGBS verileri için biyoenformatik analiz, ENCODE standart veri hatlarına göre gerçekleştirildi.

Veri kullanılabilirliği

Bu çalışmanın bulgularını destekleyen veriler, makul bir talep üzerine ilgili yazardan temin edilebilir. Mevcut çalışmada oluşturulan ve analiz edilen veri kümeleri, GSE287234 (RNA-seq), GSE286574 (ATAC-seq) ve GSE287312 (WGBS) erişim numaralarıyla GEO’da mevcuttur.

Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41421-025-00821-0