DNA Klonlama

DNA klonlama, bir gen gibi DNA’nın bir parçasının birçok özdeş kopyasını oluşturan bir moleküler biyoloji tekniğidir.
Tipik bir klonlama deneyinde hedef gen, plazmid adı verilen dairesel bir DNA parçasına yerleştirilir .
Plazmid, transformasyon adı verilen bir işlemle bakteriye sokulur ve plazmidi taşıyan bakteriler antibiyotikler kullanılarak seçilir.
Doğru plazmite sahip olan bakteriler daha fazla plazmid DNA’sı üretmek için kullanılır veya bazı durumlarda geni ifade etmeye ve protein üretmeye zorlanırlar.

Giriş

“Klonlama” kelimesini duyduğunuzda, Dolly koyunu gibi tüm organizmaların klonlanmasını düşünebilirsiniz. Ancak, bir şeyi

klonlamak , onun genetik olarak birebir kopyasını yapmak anlamına gelir. Bir moleküler biyoloji laboratuvarında, en sık klonlanan şey bir gen veya başka bir küçük DNA parçasıdır.Moleküler biyolog olan arkadaşınız “klonlamanın” işe yaramadığını söylüyorsa, büyük ihtimalle bir sonraki Dolly’yi yapmaktan değil, DNA parçalarını kopyalamaktan bahsediyordur!

DNA klonlamanın genel görünümü

DNA klonlama, belirli bir DNA parçasının birden fazla, özdeş kopyasını yapma sürecidir. Tipik bir DNA klonlama prosedüründe, ilgi duyulan gen veya diğer DNA parçası (belki de tıbbi açıdan önemli bir insan proteini için bir gen) önce plazmid adı verilen dairesel bir DNA parçasına yerleştirilir

. Ekleme, DNA’yı “kesip yapıştıran” enzimler kullanılarak yapılır ve birden fazla kaynaktan gelen parçalardan bir araya getirilen bir

rekombinant DNA molekülü veya DNA üretir .

Rekombinant DNA molekülünün yapısını gösteren diyagram. Dairesel bir plazmid DNA parçasının uçlarında bir gen parçasınınkilerle eşleşen çıkıntılar vardır. Plazmid ve gen parçası bir araya gelerek gen içeren bir plazmid üretir. Bu gen içeren plazmid, rekombinant DNA'nın veya birden fazla kaynaktan gelen DNA'dan bir araya getirilen bir DNA molekülünün bir örneğidir.

Daha sonra, rekombinant plazmid bakterilere sokulur. Plazmidi taşıyan bakteriler seçilir ve büyütülür. Üredikçe, plazmidi çoğaltır ve yavrularına aktarır, içerdiği DNA’nın kopyalarını yaparlar.Bir plazmidde bir DNA dizisinin birçok kopyasını yapmanın amacı nedir? Bazı durumlarda, deneyler yapmak veya yeni plazmidler oluşturmak için çok sayıda DNA kopyasına ihtiyacımız olur. Diğer durumlarda, DNA parçası yararlı bir protein kodlar ve bakteriler proteini yapmak için “fabrika” olarak kullanılır. Örneğin, insan insülin geni, diyabetlilerin kullandığı insülini yapmak için

E. coli bakterisinde ifade edilir.İnsülin ve diyabet hakkında daha fazla bilgi

DNA klonlamanın adımları

DNA klonlaması birçok amaç için kullanılır. Örnek olarak, DNA klonlamasının bakterilerde bir proteini (insan insülini gibi) sentezlemek için nasıl kullanılabileceğini görelim. Temel adımlar şunlardır:

Plazmidi kesip genin içine “yapıştırın”. Bu süreç restriksiyon enzimlerine (DNA’yı kesen) ve DNA ligazına (DNA’yı birleştiren) dayanır.
Plazmidi bakterilere yerleştirin. Plazmidi alan bakterileri tanımlamak için antibiyotik seçimini kullanın.
Çok sayıda plazmid taşıyan bakteri yetiştirin ve bunları protein üretmek için “fabrika” olarak kullanın. Bakterilerden proteini toplayın ve saflaştırın.

Her adımı daha yakından inceleyelim.

1. DNA’yı kesip yapıştırma

Farklı kaynaklardan gelen DNA parçaları nasıl bir araya getirilebilir? Yaygın bir yöntem iki tür enzim kullanır: restriksiyon enzimleri ve DNA ligazı .

Bir restriksiyon enzimi, belirli bir hedef diziyi tanıyan ve DNA’yı o bölgede veya o bölgeye yakın iki parçaya kesen bir DNA kesme enzimidir. Birçok restriksiyon enzimi, kısa, tek zincirli çıkıntılara sahip kesik uçlar üretir. İki molekülün eşleşen çıkıntıları varsa, baz çifti oluşturabilir ve birbirine yapışabilirler. Ancak, DNA omurgasındaki boşlukları kapatan

DNA ligazı tarafından birleştirilene kadar, kırılmamış bir DNA molekülü oluşturmak için birleşmezler.Restriksiyon enzimleri ve DNA ligazının bir diyagramını görün

A diagram of four images showing the actions of a restriction enzyme and DNA ligase. The first image has the caption Enzyme cuts DNA and there is a segment of 2 parallel strands of DNA surrounded by a structure labeled restriction enzyme. The top strand of DNA has the sequence G, A, A, T, T, C and there is a red arrow pointing between the G and the A. The bottom strand of the DNA has the sequence C, T, T, A, A, G and there is a red arrow pointing between the A and the G. An arrow points to the second image with the caption Fragments have single stranded overhangs. The DNA strands are shown in 2 fragments. The top strand of the first fragment has a G and the bottom strand has the sequence C, T, T, A, A. The T, T, A, A section of the sequence extends from the bottom strand and is not paired with the top strand. The top strand of DNA on the second fragment has the sequence A, A, T, T, C and the A, A, T, T overhangs the bottom strand and is not paired with the bottom strand. The bottom strand has a G that is paired with the C on the top strand. An arrow points to the third image that has the caption Fragments with matching overhangs base-pair and stick together. The image shows 2 strands of DNA, the top strand has the sequence G followed by small gap then the sequence A, A, T, T, C. The bottom strand has the sequence C, T, T, A, A followed by a small gap then a G. An arrow points to the final image and has the caption DNA ligase seals the gap. The gaps between the G and the A on the top strand and the A and the G on the bottom strand are no longer present and the DNA base pairs have a circle around them with the label DNA ligase above the circle.

Klonlamadaki amacımız, bir hedef geni (örneğin, insan insülini için) bir plazmite yerleştirmektir. Dikkatlice seçilmiş bir restriksiyon enzimi kullanarak, şunları sindiririz:

Tek bir kesim yeri olan plazmit
Her iki ucuna yakın bir kesim yeri bulunan hedef gen parçası

Daha sonra parçaları DNA ligaz ile birleştirerek geni içeren rekombinant plazmit oluşturuyoruz.

Basitleştirilmiş bir şemada restriksiyon sindirimi ve ligasyonu gösteren diyagram. Dairesel bir bakteri plazmidi ve bir hedef genle başlıyoruz. Hedef genin iki ucunda restriksiyon bölgeleri veya belirli bir restriksiyon enzimi tarafından tanınan DNA dizileri bulunur. Plazmidde, bakterilerde ifadeyi yönlendirecek bir promotörün hemen ardından aynı enzim tarafından tanınan bir restriksiyon bölgesi de bulunur. Hem plazmid hem de hedef gen restriksiyon enzimi tarafından (ayrı ayrı) sindirilir. Parçalar saflaştırılır ve birleştirilir. Eşleşen "yapışkan uçlara" veya tek iplikli DNA çıkıntılarına sahiptirler, böylece birbirine yapışabilirler. DNA ligaz enzimi, eşleşen uçlara sahip parçaları birleştirerek tek, kırılmamış bir DNA molekülü oluşturur. Bu, hedef geni içeren rekombinant bir plazmid üretir.

2. Bakteriyel dönüşüm ve seçilim

Plazmitler ve diğer DNA’lar, laboratuvarlarda kullanılan zararsız

E. coli gibi bakterilere,

dönüşüm adı verilen bir işlemle sokulabilir .

Dönüşüm sırasında , özel olarak hazırlanmış bakteri hücrelerine, yabancı DNA’yı almalarını teşvik eden bir şok (yüksek sıcaklık gibi) verilir.

Ligasyonla üretilen DNA (istenen plazmidlerin, yan ürün plazmidlerinin ve doğrusal DNA parçalarının bir karışımı olabilir) bakterilere eklenir. Bakterilere ısı şoku verilir, bu da onları dönüşüm yoluyla DNA almaya daha yatkın hale getirir. Ancak, bakterilerin yalnızca çok küçük bir azınlığı bir plazmidi başarıyla alacaktır.

Isı şoku bakterilerin DNA’sını neden alır?Bir plazmid tipik olarak bakterilerin belirli bir antibiyotiğin varlığında hayatta kalmasını sağlayan bir

antibiyotik direnç geni içerir. Bu nedenle, plazmidi alan bakteriler antibiyotiği içeren besin plakalarında seçilebilir. Plazmidi olmayan bakteriler ölürken, plazmid taşıyan bakteriler yaşayabilir ve çoğalabilir. Hayatta kalan her bakteri , aynı plazmidi taşıyan özdeş bakterilerden oluşan küçük, nokta benzeri bir grup veya

koloniye yol açacaktır .

Sol panel: Antibiyotik direnç geni içerdiğini gösteren plazmidin diyagramı. Sağ panel: Dönüşümden gelen tüm bakteriler bir antibiyotik plakasına yerleştirilir. Plazmidi olmayan bakteriler antibiyotik nedeniyle ölür. Plazmidi olan her bakteri bir koloni veya aynı plazmidi içeren bir klonal bakteri grubu oluşturur. Tipik bir koloni, iğne başı büyüklüğünde küçük, beyazımsı bir noktaya benzer.

Tüm koloniler mutlaka doğru plazmidi içermeyecektir. Bunun nedeni, bir ligasyon sırasında DNA parçalarının her zaman tam olarak istediğimiz şekilde “yapıştırılmamasıdır”. Bunun yerine, birkaç koloniden DNA toplamalı ve her birinin doğru plazmidi içerip içermediğine bakmalıyız.

Restriksiyon enzimi sindirimi ve PCR gibi yöntemler , plazmitleri kontrol etmek için yaygın olarak kullanılır.

3. Protein üretimi

Doğru plazmite sahip bir bakteri kolonisi bulduğumuzda, plazmid taşıyan bakterilerden oluşan büyük bir kültür yetiştirebiliriz. Daha sonra, bakterilere hedef proteini yapmaları talimatını veren bir kimyasal sinyal veririz.Bakteriler, büyük miktarda protein üreten minyatür “fabrikalar” olarak hizmet eder. Örneğin, plazmidimiz insan insülin genini içeriyorsa, bakteri geni kopyalamaya ve mRNA’yı tercüme ederek birçok insan insülin proteini molekülü üretmeye başlar.Bakterilerde insan genlerinin ifade edilmesi hakkında daha fazla bilgi

Seçilmiş bir koloni büyük bir kültürde (örneğin, 1 litrelik bir şişe) büyütülür. Büyük kültürdeki bakteriler plazmidde bulunan geni ifade etmeye teşvik edilir, bu da genin mRNA'ya transkribe edilmesine ve mRNA'nın proteine çevrilmesine neden olur. Gen tarafından kodlanan protein bakterinin içinde birikir.

Protein üretildikten sonra, bakteri hücreleri proteini serbest bırakmak için bölünebilir. Bakterilerde hedef proteinin (örneğin insülin) yanı sıra birçok başka protein ve makromolekül de yüzer. Bu nedenle, hedef proteinin saflaştırılması

veya biyokimyasal tekniklerle hücrelerin diğer içeriklerinden ayrılması gerekir. Saflaştırılmış protein deneyler için kullanılabilir veya insülin durumunda hastalara uygulanabilir.İnsülin üretmek gerçekten bu kadar basit mi?

DNA klonlamanın kullanımları

Klonlama teknikleriyle oluşturulan DNA molekülleri moleküler biyolojide birçok amaç için kullanılır. Örneklerin kısa bir listesi şunları içerir:

Biyofarmasötikler. DNA klonlaması, yukarıda belirtilen insülin gibi biyomedikal uygulamalara sahip insan proteinleri yapmak için kullanılabilir. Rekombinant proteinlerin diğer örnekleri arasında, hormonu sentezleyemeyen hastalara verilen insan büyüme hormonu ve felçleri tedavi etmek ve kan pıhtılarını önlemek için kullanılan doku plazminojen aktivatörü (tPA) bulunur. Bunlar gibi rekombinant proteinler genellikle bakterilerde yapılır.
Gen terapisi. Bazı genetik bozukluklarda, hastalar belirli bir genin işlevsel formundan yoksundur. Gen terapisi, bir hastanın vücudundaki hücrelere genin normal bir kopyasını sağlamaya çalışır. Örneğin, DNA klonlaması, kistik fibrozda işlevsel olmayan genin normal bir versiyonunu içeren plazmitler oluşturmak için kullanıldı. Plazmitler kistik fibroz hastalarının akciğerlerine iletildiğinde, akciğer fonksiyonu daha az hızlı bozuldu\[^2\].
Gen analizi. Temel araştırma laboratuvarlarında, biyologlar genellikle bir organizmadaki normal genlerin nasıl işlediğini anlamalarına yardımcı olan genlerin yapay, rekombinant versiyonlarını oluşturmak için DNA klonlamayı kullanırlar.Bir örnek görün

Bunlar DNA klonlamanın günümüzde biyolojide nasıl kullanıldığına dair sadece birkaç örnek. DNA klonlama, çok çeşitli moleküler biyoloji uygulamalarında kullanılan çok yaygın bir tekniktir.

Kaynak: Khan Academy, DNA klonlamanın tanımı, amacı ve temel adımları. Alınma tarihi; 29.07.2024